N－乙酰半胱氨酸對納米二氧化硅所致細胞毒性的抑制作用

耿維佳，李 陽，于永波，于 洋，段軍超，楊玉梅，鄒 洋，3，孫志偉

（1.首都醫科大學公共衛生學院衛生毒理與衛生化學學系，北京 100069；2.首都醫科大學環境毒理學北京市重點實驗室，北京 100069；3.首都醫科大學附屬北京友誼醫院 北京熱帶醫學研究所，北京 100050）

納米材料（nanomaterials）是指在三維空間中至少有一個維度處于納米尺度（1～100nm）或由其作為基本單元構成的材料。近年來，隨著納米材料在生產、生活中的廣泛應用，人們對其可能導致的有害生物學效應也越加重視［1－3］。納米二氧化硅（silica dioxide，SiO2）是應用最廣泛的一種工程化納米材料。已有研究［4］表明：納米SiO2顆粒可通過多種暴露途徑進入人體，如呼吸道和皮膚等。進入人體后，可進入血液循環，主要作用于肝、脾等網狀內皮組織。有研究［5－6］表明：納米材料致細胞毒性的主要原因是引起細胞中過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生。N－乙酰半胱氨酸（N－acetyl－cysteine，NAC）是谷胱甘肽的前體，是一種硫醇類化合物，常作為抗氧化劑被應用于細胞實驗中。國內外研究［7－9］表明：NAC對納米材料所致的細胞毒性和遺傳毒性有一定的抑制作用。然而，關于NAC對納米SiO2顆粒保護作用最適濃度的研究尚未見報道。本研究選用人正常肝細胞L－02，觀察NAC對納米SiO2顆粒導致細胞毒性的抑制作用，確定最適NAC濃度，為納米SiO2顆粒細胞毒性的研究提供實驗依據，以期能對納米SiO2顆粒的安全性評價和合理應用提供幫助。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器 L－02細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。粒徑為68nm的納米SiO2顆粒由吉林大學化學學院惠贈，RPMI－1640培養基購自美國 Hyclone公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，胰蛋白酶購自南京凱基生物科技發展有限公司，四甲基偶氮唑藍（MTT）購自美國Sigma公司，NAC粉末購自北京索萊寶生物有限公司，二甲基亞砜購自沈陽試劑五廠，DCFH－DA熒光探針購自碧云天生物技術研究所，本實驗所用化學試劑均為分析純。超凈工作臺（NUNR公司，美國），CO2細胞培養箱（SANYO公司，日本），酶標儀（Thermo公司，美國），倒置生物顯微鏡（Olympus公司，日本），高速離心機（Beckman公司，美國），熒光酶標儀（Bio－Tek公司，美國）。

1.2 細胞培養 L－02細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI－1640培養液中，加入100U·mL－1青霉素和100mg·L－1鏈霉素，置于37℃、5%CO2的恒溫恒濕培養箱中培養。2～3d傳代1次。取對數生長期細胞進行實驗。

1.3 細胞存活率檢測 取對數生長期細胞，用37℃水浴處理的胰蛋白酶消化后，1000r·min－1離心5min，以1×105mL－1密度接種于96孔板中，每孔100μL，并設空白孔，在37℃、5%CO2的培養箱中貼壁培養。24h后，用PBS洗細胞1次，加入用RPMI－1640稀釋的不同濃度NAC工作液（1、2、5和10mmol·L－1），陰性對照組為RPMI－1640培養液，每孔100μL，每組6個復孔。37℃預處理1h后，用PBS洗細胞2次，加入無血清RPMI－1640培養液繼續培養24h，每孔加入濃度為5g·L－1MTT溶液10μL，37℃孵育4h。吸去孔內液體，每孔加入二甲基亞砜100μL，搖床震蕩20min。用酶標儀在490nm波長下測定各孔吸光度（A）值，計算細胞存活率。細胞存活率＝（實驗孔A值－空白孔A值）／（對照孔A值－空白孔A值）×100%。納米SiO2顆粒暴露組在加入NAC預處理1h后，用PBS洗細胞2次，加入用RPMI－1640稀釋的50mg·L－1納米SiO2顆粒，繼續培養24h后加入MTT 10μL，在37℃條件下孵育4h，吸凈液體后加入二甲基亞砜100μL，震蕩20min后用酶標儀測定。

1.4 細胞形態學觀察 在倒置顯微鏡下觀察用5mmol·L－1NAC預處理后、暴露于50mg·L－1納米SiO2顆粒的L－02細胞的數目及形態學改變。

1.5 細胞中ROS水平檢測 取對數生長期細胞，用37℃水浴處理的胰蛋白酶消化后，1000r·min－1離心5min，以1×105mL－1密度接種于96孔白板中，每孔100μL，在37℃、5%CO2的培養箱中貼壁培養。24h后，先用PBS洗細胞1次，然后加入5mmol·L－1NAC工作液，在37℃預處理細胞1h，不加NAC組加入RPMI－1640培養液。用PBS洗2次，加入用RPMI－1640稀釋的不同濃度納米SiO2顆粒（10、20、50和100mg·L－1），對照組加入 RPMI－1640培養液，每孔100μL，每組6復孔，37℃染毒24h。棄培養液，用PBS洗細胞1次，加入用RPMI－1640稀釋的DCFH－DA工作液，每孔100μL，在37℃避光孵育30min之后用PBS洗3次，使用熒光酶標儀測定熒光強度（激發波長488nm，發射波長525nm）。結果用6個復孔的熒光強度均值表示。

1.6 統計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。各組細胞存活率和熒光強度均以表示，組間比較采用方差分析。

2 結 果

2.1 不同濃度NAC預處理后細胞的存活率MTT檢測結果表明：用濃度為1、2、5和10mmol·L－1NAC處理細胞1h后，細胞存活率均高于對照組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。當NAC濃度為5mmol·L－1時，細胞存活率最高，為 108.80%；當NAC濃度達到10mmol·L－1時，細胞存活率較5mmol·L－1NAC處理組有所下降，為106.87%。見表1。

2.2 不同濃度NAC預處理后暴露于納米SiO2顆粒的細胞存活率 MTT檢測結果表明：細胞暴露于50mg·L－1納米SiO2顆粒24h后，細胞存活率下降至72.79%，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。加入不同濃度 NAC預處理，再用50mg·L－1納米SiO2顆粒染毒24h，細胞存活率呈現隨NAC濃度先升高后降低的趨勢，并在5mmol·L－1時達到峰值。加入濃度為5mmol·L－1NAC對納米SiO2顆粒所致細胞毒性的抑制作用最明顯，與不加NAC的納米SiO2暴露組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 細胞形態學變化 在不加入納米SiO2顆粒組中，NAC預處理組的細胞形態與不加NAC組比較無明顯變化，均可見數目較多的不規則形狀細胞，細胞邊界清晰。加入50mg·L－1納米SiO2顆粒后，與不加納米SiO2顆粒的對照組比較，細胞數目明顯減少，圓形固縮細胞增多，邊界不清。與不加NAC組比較，NAC預處理的50mg·L－1納米SiO2顆粒暴露組細胞數目有所增加，細胞邊界較明顯。見圖1（插頁四）。

2.4 細胞中ROS水平 細胞暴露于不同濃度納米SiO2顆粒（10、20、50和100mg·L－1）后，隨納米SiO2顆粒濃度的升高，細胞中ROS水平呈升高趨勢，50和100mg·L－1納米SiO2顆粒暴露組與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。在相同納米SiO2顆粒濃度下，加入5mmol·L－1NAC處理組與不加NAC處理組細胞中ROS水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表1 不同濃度NAC預處理后L－02細胞存活率Tab.1 Cell viabilities of L－02cells after pretreatment of different concentrations of NAC （，η／%）

表1 不同濃度NAC預處理后L－02細胞存活率Tab.1 Cell viabilities of L－02cells after pretreatment of different concentrations of NAC （，η／%）

Group Concentration（mmol·L－1）Cell viabilit y Control 0 100.00±13.94 NAC 1 104.51±8.082 102.31±11.545 108.80±7.6810 106.87±8.50

表2 不同濃度NAC預處理后暴露于納米SiO2顆粒的L－02細胞存活率Tab.2 Cell viabilities of L－02cells after different concentrations of NAC pretreatment and SiO2nanoparticle exposure （，η／%）

表2 不同濃度NAC預處理后暴露于納米SiO2顆粒的L－02細胞存活率Tab.2 Cell viabilities of L－02cells after different concentrations of NAC pretreatment and SiO2nanoparticle exposure （，η／%）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs SiO2（50mg·L－1）group.

Group Cell viabilit y Control 100.00±13.94 SiO2（50mg·L－1）72.79±5.91＊SiO2（50mg·L－1）＋NAC（1mmol·L－1）77.89±5.90 SiO2（50mg·L－1）＋NAC（2mmol·L－1）81.96±10.61 SiO2（50mg·L－1）＋NAC（5mmol·L－1）86.37±20.06△SiO2（50mg·L－1）＋NAC（10mmol·L－1）74.93±5.84

表3 各組L－02細胞中ROS水平Tab.3 Intracellular ROS levels in L－02cells in various groups （）

表3 各組L－02細胞中ROS水平Tab.3 Intracellular ROS levels in L－02cells in various groups （）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs SiO2（10mg·L－1）group；#P＜0.05 vs SiO2（20mg·L－1）group；○P＜0.05 vs SiO2（20mg·L－1）group；▲P＜0.05 vs SiO2（100mg·L－1）group.

Group ROS level（fluorescence intensity Control 12.47±1.53 SiO2（10mg·L－1）12.79±0.71 SiO2（20mg·L－1）13.98±1.58 SiO2（50mg·L－1）15.40±1.98＊SiO2（100mg·L－1）15.84±3.85＊NAC（5mmol·L－1）10.52±0.29＊SiO2（10mg·L－1）＋NAC（5mmol·L－1）10.68±0.56△SiO2（20mg·L－1）＋NAC（5mmol·L－1）10.58±0.21#SiO2（50mg·L－1）＋NAC（5mmol·L－1）10.49±0.24○SiO2（100mg·L－1）＋NAC（5mmol·L－1） 10.26±0.22）▲

3 討 論

納米SiO2是目前世界上大規模生產的產量最高的一種納米粉體材料，具有化學純度高、分散性好和比表面積大等特性，在材料、化工、紡織、軍事和化妝品等領域得到廣泛應用。此外，其在醫藥領域如藥物載體、生物傳感器和癌癥治療方面也有十分廣闊的應用前景［10］。納米SiO2顆粒的職業暴露、環境暴露和醫源性暴露使其可通過呼吸道、消化道以及皮膚等途徑進入人體，對機體造成潛在危害［11－12］。因此，本實驗以人正常肝細胞 L－02作為模型研究納米SiO2顆粒的細胞毒性，具有實際意義。

近年來，國內外一些課題組的研究［13］結果表明：納米SiO2顆粒可被細胞攝取，分布于胞質、溶酶體和線粒體等細胞器中。納米SiO2顆粒可導致細胞凋亡、細胞自噬，還可直接和間接損傷細胞DNA［14－15］。本課題組前期的體外實驗［4］表明：急性納米SiO2顆粒暴露可引起小鼠肝細胞出現以炎細胞浸潤和肉芽腫形成為主的病理改變。隨納米SiO2顆粒給藥劑量的升高，小鼠肝臟病理變化逐漸明顯。在高劑量組可觀察到肝細胞的空泡樣改變和多處小面積的炎性細胞浸潤灶。肝臟是納米SiO2顆粒毒作用的重要靶器官。

納米材料作用于細胞后，導致細胞中ROS水平升高是其細胞毒性和遺傳毒性的主要原因。納米顆粒特殊的理化特性，使其表面活性位點與細胞接觸后，與接觸面上的氧分子反應，發生超氧離子歧化反應，產生ROS。當細胞中產生大量ROS而抗氧化系統不足以清除時，一方面可以損傷細胞膜，造成多細胞器的氧化損傷；另一方面，可導致堿基氧化損傷甚至DNA鏈斷裂。NAC是細胞實驗中常用的一種ROS抑制劑，具有直接抗氧化活性和間接抗氧化活性。NAC的巰基結構可結合ROS的親電子基團，從而消除ROS毒性。此外，NAC易于透過細胞膜，脫乙酰基后生成半胱氨酸，作為GSH 前體，實現抗氧化作用［16－18］。有研究［9］表明：NAC作為抗氧化劑可以有效抑制納米材料對細胞的氧化損傷作用。本研究觀察比較NAC對納米SiO2顆粒所致細胞毒性的抑制作用。MTT實驗結果表明：5mmol·L－1NAC既不影響L－02細胞的正常生長，又能最大限度地保護細胞。ROS測定結果表明：隨著納米SiO2顆粒濃度的升高，細胞中ROS水平呈現明顯的升高趨勢。納米SiO2顆粒的濃度越高，NAC對ROS的抑制效果就越強；表明NAC能夠較好地抑制細胞中ROS產生，降低納米SiO2顆粒的細胞毒性。

綜上所述，納米SiO2顆粒可以導致L－02細胞的存活率下降和細胞中ROS水平升高，NAC能夠通過抑制ROS產生，對暴露于納米SiO2顆粒的L－02細胞起到保護作用。細胞中ROS水平升高是納米SiO2顆粒導致人正常肝細胞毒性的作用機制之一。

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