銀杏葉提取物各組分對(duì)高糖培養(yǎng)下系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)積聚的抑制作用

蘇 青，孫成博，孫 波，姚云鵬，郭夢(mèng)環(huán)，于曉艷

（1.吉林大學(xué)第四醫(yī)院病理科，吉林 長(zhǎng)春 130011；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)藥理與毒理學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春 130021）

銀杏葉提取物 （ginkgo biloba leaf extract，GBE）主要包含黃酮類和內(nèi)酯類。黃酮類化合物主要是由槲皮素、山奈酚和異鼠李素等黃酮苷元及其與葡萄糖等單糖以氧糖苷鍵聯(lián)接而成的糖苷組成。內(nèi)酯類主要包括銀杏內(nèi)酯A、B、C。本文作者前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究［1］證實(shí)：GBE可明顯緩解糖尿病大鼠腎功能和形態(tài)學(xué)改變，Lei等［2］及本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)均顯示：GBE可改善高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì) （extracellular matrix，ECM）積聚。但關(guān)于GBE的有效成分通過何種機(jī)制起作用，目前國(guó)內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道。本研究分別從腎小球系膜細(xì)胞增殖及ECM積聚的角度，觀察GBE不同組分的作用，為闡明GBE緩解糖尿病腎病 （diabetic nephropathy，DN）的藥理作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 正常大鼠腎小球系膜細(xì)胞系HBZY－1（上海博慧斯生物科技有限公司）。GBE（2005版銀杏葉提取物，江蘇徐州華康生物制品有限公司）；GBE注射液 （金納多，德國(guó)威瑪舒培博士藥廠）；黃酮苷元槲皮素，山奈酚，異鼠李素和內(nèi)脂單體銀杏內(nèi)脂A、銀杏內(nèi)脂B、銀杏內(nèi)脂C（純度≥98%，上海同田生物技術(shù)有限公司）；DMEM （低糖）培養(yǎng)基 （美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清 （天津?yàn)笊锛夹g(shù)有限公司）；胰酶（北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司）；兔抗大鼠纖維連接蛋白 （FN）和Ⅳ型膠原 （ColⅣ）多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口分析純。CO2培養(yǎng)箱 （日本三洋公司），DG5031型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 （南京華東電子有限公司），電泳轉(zhuǎn)印裝置 （美國(guó)Bio－rad公司）。

1.2 銀杏總內(nèi)酯、無內(nèi)酯銀杏總黃酮的分離及銀杏總黃酮水解物的制備［3］采用GBE為原料分別制得含量為9.5%的銀杏總內(nèi)酯、含量為75%的銀杏總黃酮 （無內(nèi)酯）。再以銀杏葉總黃酮 （無內(nèi)酯）為原料，制備含量為95%的銀杏總黃酮水解物。

1.3 腎小球系膜細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代 大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY－1培養(yǎng)于含10%小牛血清的低糖（5.5mmol·L－1）DMEM 培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2飽和濕度，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%以上時(shí)傳代。

1.4 MTT法檢測(cè)HBZY－1細(xì)胞增殖情況 選取狀態(tài)良好的HBZY－1細(xì)胞，以2×104／孔的密度種于96孔板，10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)，24h后換用含各種銀杏葉提取物成分 （GBE、總黃酮、總內(nèi)酯、總黃酮水解物、槲皮素、山奈酚、異鼠李素、銀杏內(nèi)脂A、銀杏內(nèi)脂B和銀杏內(nèi)脂C），各成分質(zhì)量濃度均分別為0、3.125、6.250、12.500、25.000和50.000mg·L－1的10%胎牛血清的高糖DMEM （30mmol·L－1）培養(yǎng)液，以10%低糖DMEM （5.5mmol·L－1）作為低糖對(duì)照組，37℃、5%CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)72 h。鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)后吸棄條件培養(yǎng)液換成10%低糖培養(yǎng)液并且每孔加20μL的MTT溶液 （5g·L－1），37℃繼續(xù)孵育4h后，小心吸棄孔內(nèi)上清，每孔加入150μL DMSO，震蕩10min，酶標(biāo)儀490nm測(cè)定各孔吸光度 （A）值，每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以A值表示細(xì)胞增殖活性。

1.5 ELISA法檢測(cè) HBZY－1細(xì)胞上清中FN和ColⅣ水平 根據(jù)MTT結(jié)果篩選對(duì)系膜細(xì)胞增殖無明顯作用的組分，采用ELISA法檢測(cè)其對(duì)高糖作用下的系膜細(xì)胞ECM主要成分FN和ColⅣ水平的影響。細(xì)胞種于24孔板中，待80%融合后，無血清培養(yǎng)液同步24h后分別換成含GBE、總黃酮、總內(nèi)酯、銀杏內(nèi)脂A、銀杏內(nèi)脂B和銀杏內(nèi)脂C 0、0.050、0.500、5.000、50.000mg·L－1的無血清高糖DMEM（30mmol·L－1），每組4個(gè)復(fù)孔，低糖無血清DMEM作為低糖對(duì)照組，作用48h后收集的細(xì)胞上清液，采用ELISA法檢測(cè)FN和ColⅣ水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。細(xì)胞增殖活性、FN和ColⅣ水平均以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué) GBE：各濃度組細(xì)胞狀態(tài)均良好，50.000mg·L－1組細(xì)胞數(shù)目有所減少；銀杏葉總黃酮：低濃度組細(xì)胞狀態(tài)均良好，50.000mg·L－1組可見部分細(xì)胞破裂溶解；銀杏葉總內(nèi)脂：各濃度組細(xì)胞狀態(tài)均良好；總黃酮水解物：6.250和12.500mg·L－1組細(xì)胞皺縮，變圓，25.000和50.000mg·L－1組大部分細(xì)胞破裂、溶解，細(xì)胞變化具有濃度依賴性；槲皮素：6.250mg·L－1組細(xì)胞皺縮、變圓，12.500mg·L－1組 約 30% 細(xì) 胞 破 裂 溶 解，25.000 和50.000mg·L－1組大部分細(xì)胞溶解消失，細(xì)胞變化具有濃度依賴性；山奈酚：12.500mg·L－1組細(xì)胞皺縮，變圓，25.000和50.000mg·L－1組大部分細(xì)胞破裂、溶解，細(xì)胞變化具有濃度依賴性；異鼠李素：12.500和25.000mg·L－1組細(xì)胞皺縮、變圓，50.000mg·L－1組大部分細(xì)胞溶解消失，細(xì)胞變化具有濃度依賴性；銀杏內(nèi)脂A、銀杏內(nèi)脂B和銀杏內(nèi)脂C各濃度組細(xì)胞狀態(tài)均良好。

2.2 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況 與高糖對(duì)照組比較，GBE僅最高濃度組（50.000mg·L－1）細(xì)胞增殖活性明顯降低 （P＜0.01），其他濃度組細(xì)胞增殖活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；總內(nèi)脂各濃度組細(xì)胞增殖活性差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；25.000和50.000mg·L－1總黃酮組細(xì)胞增殖活性明顯降低 （P＜0.05或P＜0.01），其他低劑量組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；總黃酮水解物各濃度組細(xì)胞增殖活性均明顯降低（P＜0.01）；槲皮素、山奈酚和異鼠李素各濃度組細(xì)胞增殖活性均明顯降低 （P＜0.01）；3種內(nèi)脂成分除內(nèi)脂C 50.000mg·L－1組細(xì)胞增殖活性明顯降低 （P＜0.05），其他各濃度組細(xì)胞活性與高糖對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。見表1。

2.3 ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞FN和ColⅣ水平與高糖對(duì)照組比較，5.00和50.00mg·L－1GBE組ColⅣ和FN水平均明顯降低 （P＜0.01），0.50mg·L－1GBE組 FN 水平明顯降低 （P＜0.05）；0.50、5.00和50.00mg·L－1總黃酮組ColⅣ 水平降低 （P＜0.05或 P＜0.01）；僅50.00mg·L－1總內(nèi)脂組ColⅣ和FN水平降低（P＜0.05或P＜0.01），其他濃度組無明顯變化（P ＞ 0.05）；與高糖對(duì)照組比較，僅50.00mg·L－1內(nèi)脂 C 組 FN 水平降低 （P＜0.05），而內(nèi)脂C其他低濃度組及內(nèi)脂A、B各濃度組與高糖對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。見表2。

3 討 論

DN是糖尿病最重要的并發(fā)癥之一，尚無十分確切有效的方法能夠防止其發(fā)生和惡化。由于GBE具有擴(kuò)血管、抗凝血、降血脂、抗炎和清除自由基等作用，已被廣泛應(yīng)用于心、腦血管疾病的預(yù)防和治療。近年來，有學(xué)者［1－2，4］在 DN 的實(shí)驗(yàn)研究中證明：GBE通過多種機(jī)制對(duì)腎臟功能有明顯保護(hù)作用。此外多項(xiàng)臨床研究［5－8］表明：GBE對(duì)早期DN患者有明顯改善作用。劉曉等［9］研究發(fā)現(xiàn)：GBE對(duì)糖尿病大鼠的腎臟保護(hù)作用強(qiáng)于卡托普利和纈沙坦。

本研究首先從高糖培養(yǎng)下系膜細(xì)胞增殖角度觀察了GBE不同組分的細(xì)胞增殖活性。根據(jù)本研究中MTT結(jié)果，除苷元成分槲皮素、山奈酚、異鼠李素和總黃酮水解物外，其他各種組分包括總銀杏葉提取物、總黃酮、總內(nèi)脂和內(nèi)脂A、B、C均無較強(qiáng)的細(xì)胞抑制作用；針對(duì)這些組分，本研究又從ECM積聚角度檢測(cè)了其對(duì)高糖作用下的系膜細(xì)胞ColⅣ和FN水平的影響。為避免漏檢藥物在低濃度的作用，本實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)計(jì)為0、0.05、0.50、5.00和50.00mg·L－1。本研究結(jié)果顯示：GBE在高濃度狀態(tài)下 （50.00mg·L－1）抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖，而低濃度狀態(tài)下 （自0.50mg·L－1起）抑制系膜細(xì)胞ECM積聚；GBE中總黃酮在抑制細(xì)胞增殖和ECM積聚方面起主要作用，總內(nèi)脂無明顯效果；總黃酮作用方式同樣是高濃度狀態(tài)下對(duì)腎臟系膜細(xì)胞增殖有抑制作用，低濃度（自0.50mg·L－1起）時(shí)抑制腎臟系膜細(xì)胞ECM水平；苷元抑制系膜細(xì)胞增殖的作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于糖苷，苷元單體槲皮素、山奈酚、異鼠李素及總黃酮水解物明顯抑制腎臟系膜細(xì)胞增殖，并且具有濃度依賴性。

表1 各組系膜細(xì)胞增殖活性Tab.1 Proliferation activities of mesangial cells in various groups （n＝6，）

表1 各組系膜細(xì)胞增殖活性Tab.1 Proliferation activities of mesangial cells in various groups （n＝6，）

＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01compared with high－glucose control group.

Group A value Group A value GBE Kaempferorl Low－glucose control 0.37±0.04＊＊ Low－glucose control 0.37±0.04＊＊High－glucose control 0.47±0.06 High－glucose control 0.47±0.063.125 0.42±0.03 3.125 0.30±0.08＊＊6.125 0.48±0.04 6.125 0.10±0.03＊＊12.500 0.49±0.02 12.500 0.00±0.01＊＊25.000 0.48±0.03 25.000 0.00±0.01＊＊50.000 0.30±0.04＊＊ 50.000 0.03±0.02＊＊Total flavonoids Isorhammnetin Low－glucose control 0.37±0.04＊＊ Low－glucose control 0.37±0.04＊＊High－glucose control 0.47±0.06 High－glucose control 0.47±0.063.125 0.42±0.05 3.125 0.20±0.04＊＊6.125 0.41±0.05 6.125 0.10±0.03＊＊12.500 0.46±0.06 12.500 0.10±0.03＊＊25.000 0.38±0.02＊ 25.000 0.20±0.08＊＊50.000 0.32±0.06＊＊ 50.000 0.13±0.04＊＊Total ginkgolide Ginkgolide A Low－glucose control 0.37±0.04＊＊ Low－glucose control 0.63±0.07＊＊High－glucose control 0.47±0.06 High－glucose control 0.75±0.153.125 0.44±0.036.125 0.83±0.0312.500 0.43±0.043.125 0.85±0.156.125 0.47±0.0512.500 0.74±0.0225.000 0.42±0.0450.000 0.77±0.07 Total flavonoids hydrolyzate Ginkg 25.000 0.72±0.0250.000 0.41±0.04 olide B Low－glucose control 0.37±0.04＊＊ Low－glucose control 0.63±0.07＊＊High－glucose control 0.47±0.06 High－glucose control 0.75±0.153.125 0.20±0.06＊＊6.125 0.76±0.0712.500 0.20±0.05＊＊3.125 0.75±0.056.125 0.20±0.02＊＊12.500 0.78±0.0925.000 0.10±0.04＊＊50.000 0.70±0.06 Quercetin Ginkg 25.000 0.76±0.0650.000 0.08±0.01＊＊olide C Low－glucose control 0.37±0.04＊＊ Low－glucose control 0.63±0.07＊＊High－glucose control 0.47±0.06 High－glucose control 0.75±0.153.125 0.03±0.03＊＊6.125 0.82±0.1212.500 0.10±0.02＊＊3.125 0.74±0.076.125 0.20±0.04＊＊12.500 0.76±0.1725.000 0.00±0.01＊＊25.000 0.66±0.0450.000 0.06±0.02＊＊ 50.000 0.64±0.10＊

表2 ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞中ColⅣ和FN水平Tab.2 Levels of ColⅣand FN levels in cells in virous groups detected by ELISA （n＝6，）

表2 ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞中ColⅣ和FN水平Tab.2 Levels of ColⅣand FN levels in cells in virous groups detected by ELISA （n＝6，）

＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01compared with high－glucose control group.

FN Low－glucose control 0.94±0.05＊＊ 0.93±0.04 Group ColⅣ＊High－glucose control 0.99±0.02 0.97±0.03 GBE（mg·L－1）0.05 0.97±0.02 0.99±0.030.50 0.97±0.01 0.84±0.08＊＊5.00 0.88±0.04＊＊ 0.92±0.06＊50.00 0.71±0.06＊＊ 0.60±0.06＊＊Ginkgolide A（mg·L－1）0.05 0.96±0.01 0.95±0.040.50 0.99±0.02 0.96±0.045.00 0.99±0.01 0.96±0.0350.00 0.99±0.01 0.95±0.03 Ginkgolide B（mg·L－1）0.05 0.98±0.01 0.95±0.040.50 0.99±0.01 0.95±0.035.00 0.95±0.04 0.97±0.0150.00 0.97±0.04 0.91±0.02 Ginkgolide C（mg·L－1）0.05 0.98±0.03 0.98±0.020.50 0.98±0.02 0.95±0.035.00 0.99±0.02 0.98±0.0450.00 0.97±0.01 0.91±0.03＊＊Total flavonoids（mg·L－1）0.05 0.71±0.09 0.24±0.050.50 0.67±0.06＊ 0.24±0.055.00 0.64±0.07＊ 0.25±0.0350.00 0.62±0.08＊＊ 0.18±0.04＊＊Total ginkgolide（mg·L－1）0.05 0.76±0.08 0.26±0.050.50 0.75±0.04 0.29±0.075.00 0.72±0.06 0.29±0.1150.00 0.61±0.11＊＊ 0.17±0.04＊

DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，腎組織氧化應(yīng)激作用增強(qiáng)及抗氧化能力降低在其發(fā)生發(fā)展中起重要作用［10］。而GBE可減輕糖尿病大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，能預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展［11］。任明等［12］研究發(fā)現(xiàn)：GBE改善糖尿病大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀況，可能與其具備抗氧化活性，降低糖尿病大鼠體內(nèi)的丙二醛 （MDA）和超氧陰離子 （O2－）水平并減弱蛋白激酶C（PKC）的表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示：對(duì)于抑制細(xì)胞增殖和ECM積聚方面，GBE中總黃酮起主要作用，本文作者推測(cè)與銀杏黃酮的抗氧化應(yīng)激藥理作用有關(guān)。本研究結(jié)果表明：對(duì)于黃酮成分，黃酮苷元成分活性明顯強(qiáng)于黃酮糖苷。大量研究［13］顯示：黃酮苷元清除人體氧自由基的生物活性明顯優(yōu)于黃酮糖苷。

本研究結(jié)果中銀杏葉總內(nèi)脂無論是從抑制細(xì)胞增殖角度還是ECM積聚角度方面均無明顯效果，僅內(nèi)脂C在50.000mg·L－1時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用。當(dāng)然出現(xiàn)這種結(jié)果并不意味著銀杏葉內(nèi)脂針對(duì)糖尿病腎病無有效藥理作用，抑制細(xì)胞增殖和ECM集聚僅是糖尿病發(fā)病的部分機(jī)制。銀杏內(nèi)脂A、B、C均是血小板活化因子 （PAF）的強(qiáng)拮抗劑［14－16］，改善腎臟血流量同樣是糖尿病腎病的一個(gè)重要治療手段，因此要全面評(píng)價(jià)銀杏葉內(nèi)脂的腎臟保護(hù)作用，還需進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

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