攪打奶油中金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的建立

賴(lài)章林,李柏林,歐杰*,嚴(yán)維凌

1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海201306

2.上海市食品研究所,上海200235

攪打奶油中金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的建立

賴(lài)章林1,李柏林1,歐杰1*,嚴(yán)維凌2

1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海201306

2.上海市食品研究所,上海200235

國(guó)內(nèi)外對(duì)金黃色葡萄球菌預(yù)測(cè)模型的研究集中處于一、二級(jí)模型，且乳品方面的研究又集中在牛奶，而微生物在攪打奶油的生長(zhǎng)模型研究基本處于空白。為了填補(bǔ)金黃色葡萄球菌在攪打奶油中生長(zhǎng)行為變化的空白，為金黃色葡萄球菌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供數(shù)據(jù)支持。本文選用產(chǎn)A型腸毒素的金黃色葡萄球菌作為研究對(duì)象，測(cè)定了15℃、20℃、25℃、30℃、36℃下金黃色葡萄球菌在新鮮奶油中的生長(zhǎng)曲線，運(yùn)用Origin8.0軟件和DMFit軟件，分別使用修正的Gompertz、修正的Logistic和Baranyi三模型來(lái)擬合不同溫度下的生長(zhǎng)模型。通過(guò)比較三種模型的擬合結(jié)果，選擇最適模型的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，選用平方根方程構(gòu)建金黃色葡萄球菌最大比生長(zhǎng)速率與溫度的二級(jí)模型。結(jié)果顯示，Baranyi模型對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線擬合效果最好，構(gòu)建的二級(jí)平方根模型擬合度較好：R2為0.92，準(zhǔn)確因子（Af）和偏差因子（Bf）均在1左右。所構(gòu)建的二級(jí)模型，能真實(shí)快速有效地預(yù)測(cè)15～36℃金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)情況。

攪打奶油;溫度;金黃色葡萄球菌;生長(zhǎng)模型

攪打奶油又稱(chēng)稀奶油，其含有35%左右的乳脂含量，經(jīng)攪打打發(fā)后從流動(dòng)狀變?yōu)榉橇鲃?dòng)狀并具有可塑性，體積增加數(shù)倍，是制作夾芯蛋糕、裱花蛋糕、提拉米蘇、泡芙等西式烘焙食品的重要原料。商品化的攪打奶油都是商業(yè)無(wú)菌的，但在其后的加工貯藏環(huán)節(jié)包括攪打、裱花等都涉及到大量的人工操作，長(zhǎng)時(shí)間在空氣中暴露，而金黃色葡萄球菌作為自然界中常見(jiàn)的微生物，大多是依附在人的皮膚、黏膜、鼻孔、咽、胃腸道或泌尿系統(tǒng)等[1,2]，同時(shí)乳和乳制品是金黃色葡萄球菌的主要宿主，當(dāng)制作蛋糕等烘焙食品的面包房衛(wèi)生消毒措施不到位時(shí)，就有可能導(dǎo)致加工好的食品受金黃色葡萄球菌污染并導(dǎo)致食物中毒[3]。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus）可引起多種組織器官的化膿性炎癥，能導(dǎo)致很多種疾病的病原微生物，這種致病可能與其產(chǎn)生的多種外毒素和其他毒力因子有關(guān)，如毒素休克綜合癥-1，剝脫毒素和腸毒素[4,5]，腸毒素是引起金黃色葡萄球菌食物中毒的主要因子。100 ng的腸毒素即可引

起嘔吐、腹痛、腹瀉等食物中毒癥狀[6,7]，腸毒素還有著極強(qiáng)的耐熱特性[8]。近年來(lái)發(fā)生的金黃色葡萄球菌腸毒素感染事件如2000年日本雪印奶粉事件等[9]。

預(yù)報(bào)微生物學(xué)可以在不測(cè)的情況下即可知道待測(cè)食品的食用價(jià)值及不穩(wěn)定因素，打破傳統(tǒng)微生物檢測(cè)受時(shí)間約束而滯后的問(wèn)題，在食品貨架期與食品安全檢測(cè)方面具有極高價(jià)值。通過(guò)監(jiān)測(cè)金黃色葡萄球菌在不同溫度下的攪打奶油中的生長(zhǎng)，建立生長(zhǎng)模型是預(yù)測(cè)攪打奶油中金黃色葡萄球菌的菌數(shù)及產(chǎn)毒情況的有效手段。

國(guó)內(nèi)外對(duì)金黃色葡萄球菌預(yù)測(cè)模型的研究集中處于一、二級(jí)模型，且乳品方面的研究又集中在牛奶，而微生物在攪打奶油的生長(zhǎng)模型研究基本處于空白。趙鳳[10]用Gompertz模型、Logistic模型、多項(xiàng)式方程擬合10～36℃的原料乳中的金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)模型，通過(guò)對(duì)各模型均方誤差（MSE）和實(shí)際擬合生長(zhǎng)曲線的分析，得出10～18℃下的最適生長(zhǎng)模型為多項(xiàng)式方程，20～23℃下的最適生長(zhǎng)模型為L(zhǎng)ogistic模型，25～36℃下的最適生長(zhǎng)模型為Gompertz模型。Hiroshi Fujikawa[11,12]等人用修正的Logistic，當(dāng)菌的數(shù)目達(dá)到了6.5 logCFU/mL時(shí)，牛奶中的毒素的產(chǎn)量將隨時(shí)間線性增長(zhǎng)，甚至當(dāng)細(xì)菌數(shù)目達(dá)到了穩(wěn)定期時(shí)也是這樣的。雖然腸毒素的檢測(cè)方法很多[6][13,14]，但是在實(shí)際應(yīng)用中，為了省去毒素檢測(cè)的環(huán)節(jié)，模型是必需的。

針對(duì)毒素產(chǎn)生的問(wèn)題，許多的學(xué)者對(duì)培養(yǎng)基中的金黃色葡萄球菌的產(chǎn)毒條件進(jìn)行了研究，最終發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)金黃色葡萄球菌的數(shù)量達(dá)到了一定的濃度時(shí)才會(huì)產(chǎn)生毒素。本研究首次研究攪打奶油，簡(jiǎn)要概述了攪打奶油以及其易受微生物感染的原因，在不同的溫度下，通過(guò)多模型對(duì)比，從而得出可以預(yù)測(cè)攪打奶油中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)狀態(tài)的模型。在現(xiàn)實(shí)生活中，為攪打奶油的食用性定性提供了理論基礎(chǔ)。監(jiān)測(cè)金黃色葡萄球菌在不同溫度下攪打奶油中的生長(zhǎng)，建立一級(jí)模型，選擇最優(yōu)一級(jí)模型，在此基礎(chǔ)上建立二級(jí)模型。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產(chǎn)A型腸毒素金黃色葡萄球菌（SA14966）上海市食品研究所保存，零下30℃凍藏于40%甘油溶液中；1 L裝Anchor攪打奶油新西蘭產(chǎn)（國(guó)內(nèi)市購(gòu)）；Petrifilm?金黃色葡萄球菌測(cè)試片美國(guó)3M公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯上海華康科技開(kāi)發(fā)有限公司。

Xiang Yi H-2050R離心機(jī)長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；KM020多功能食品處理機(jī)英國(guó)健伍股份有限公司；隔水式溫培養(yǎng)箱上海-恒科技術(shù)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)藥設(shè)備廠；烘箱DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海-恒科技術(shù)有限公司；MJ-II霉菌培養(yǎng)箱上海-恒科技術(shù)有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱上海醫(yī)療器械七廠；THZ-82A氣浴恒溫振蕩器金壇市城西天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠；電子天平PL6001-L梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 制備菌懸液

從保存的平板培養(yǎng)基中取出一環(huán)菌量，接種到250 mL盛有營(yíng)養(yǎng)肉湯的三角燒瓶里，置于搖床培搖床培養(yǎng)（100 r/min，37℃，18～20 h）。

1.3 帶菌攪打奶油的制備

將1 L奶油倒入奶油攪打機(jī)中，用移液槍加入1 mL菌液，攪打5 min，攪打后，將奶油移至大燒杯中。然后置于恒溫下培養(yǎng)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 金黃色葡萄球菌的接菌、培養(yǎng)和計(jì)數(shù)本實(shí)驗(yàn)采用不同的溫度，原始菌液約8 logCFU/mL，通過(guò)梯度稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)計(jì)數(shù)可以得出初始菌接菌濃度約為2～3 logCFU/mL。

實(shí)驗(yàn)選定了15±1℃、20±1℃、25±1℃、30±1℃、36±1℃這5個(gè)溫度下，不同的溫度，不同時(shí)刻，稀釋梯度不同，在選定的時(shí)間，用電子天平無(wú)菌稱(chēng)取10 g樣品置于裝有90 mL無(wú)菌生理鹽水的采樣杯中。再用移液槍在9 mL的無(wú)菌生理鹽水中做梯度稀釋?zhuān)捎肞etrifilm?金黃色葡萄球菌測(cè)試片進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他具體過(guò)程參見(jiàn)國(guó)標(biāo)GBT4789.10-2010[15]，測(cè)試片在37℃下恒溫培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)，每次做兩個(gè)平行樣。

1.4.2 建立生長(zhǎng)模型應(yīng)用Origin8.0軟件擬合和DMFit（http://modelling.combase.cc/DMFit.aspx）來(lái)擬合生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，修正的Logistic[16]、修正的Gompertz[16]模型通過(guò)Origin8.0擬合，Baranyi[17]模型通過(guò)DMFit擬合。通過(guò)這三個(gè)模型擬合不同溫度下金黃色葡萄球菌隨時(shí)間生長(zhǎng)的對(duì)比，得出最適合建立二級(jí)模型的一級(jí)模型。以下是三個(gè)模型的方程：

修正的Gompertz:

修正的Logistic:

Baranyi and Roberts:

式（1）、（2）中l(wèi)og(Nt)是t時(shí)的菌落數(shù)的對(duì)數(shù)值[log(CFU/mL)]。log(N0)是初始的菌數(shù)[log(CFU/mL)]，A是擬合參數(shù)，μm是最大比生長(zhǎng)速率h-1，λ是滯后期h。式（3）中y0和ymax分別是細(xì)菌的初始菌量和最大菌量，tlag是滯后期。

溫度對(duì)生長(zhǎng)速率的影響用平方根方程[18]來(lái)擬合，方程如下：

式中a，Tmin是擬合參數(shù)，a是回歸系數(shù)，Tmin表示細(xì)菌理論的最低生長(zhǎng)溫度，是最大比生長(zhǎng)速率h-1，T是溫度℃。通過(guò)對(duì)比三個(gè)一級(jí)模型，得出最佳的一級(jí)模型，從而得出對(duì)應(yīng)的比生長(zhǎng)速率和對(duì)應(yīng)的溫度，將其代入式（4）中，同過(guò)Origin8.0擬合，從而得出Tmin和a的值。

1.4.3 模型的檢驗(yàn)通過(guò)一級(jí)模型得出的R2和最大比生長(zhǎng)速率μm來(lái)判斷一級(jí)模型是否適合建立二級(jí)模型，二級(jí)模型的驗(yàn)證則是通過(guò)比較均方根誤差（Root Mean Square Error,RMSE）[19]、殘差平方和(RSS)、偏差度（Bias Factor,Bf）以及準(zhǔn)確度（Accuracy Factor,Af）[20]，進(jìn)而了解所構(gòu)建模型所得到的預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)所得真實(shí)值之間的差異。

式中μp，μd是最大比生長(zhǎng)速率的預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值，其中實(shí)驗(yàn)的次數(shù)n為5。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌的一級(jí)模型的建立

用Origin8.0分別用修正的Gompertz和修正的Logistic擬合15±1℃、20±1℃、25±1℃、30±1℃、36±1℃條件下的金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，得出參數(shù)如下：

表1 修正的Gompertz模型參數(shù)Table 1 Statistic analysis of growth parameters of modified Gompertz

表2 修正的Logistic模型參數(shù)Table 2 Statistic analysis of growth parameters of modified Logistic

用DMFit軟件中的Baranyi模型來(lái)擬合不同溫度下的金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，得到的生長(zhǎng)參數(shù)如下：

表3 Baranyi模型參數(shù)Table 3 Statistic analysis of growth parameters of Baranyi

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，三個(gè)模型分別在5個(gè)溫度下的擬合R2都超過(guò)了0.9，說(shuō)明三個(gè)模型都能擬合，但是在30℃時(shí)，修正的Logistic模型和修正的Gompertz模型擬合得到的μm都不合理，所以最適合用Baranyi模型得到的參數(shù)來(lái)建立二級(jí)模型。

以下是以log(Nt)為縱坐標(biāo)，時(shí)間t為橫坐標(biāo)建立的Baranyi模型：如圖1。

圖1 是(a)15℃、(b)20℃、(c)25℃、(d)30℃、(e)36℃條件下奶油中的金黃色葡萄球菌的一級(jí)生長(zhǎng)模型Fig.1 The primary growth model for Staphylococcus aureus in cream at(a)15℃,(b)20℃,(c)25℃,(d)30℃,(e)36℃

2.2 建立金黃色葡萄球菌的二級(jí)生長(zhǎng)模型

通過(guò)Baranyi模型得到了不同溫度的最大比生長(zhǎng)速率μm代入平方根方程，得到了最大比生長(zhǎng)速率與溫度的二級(jí)模型，擬合曲線如圖2。

圖2 最大比生長(zhǎng)速率與溫度的二級(jí)模型擬合曲線圖Fig.2 Fitted μmand temperature of the secondary model

得到了擬合方程：

從圖2可以看出，在15～36℃這一溫度范圍內(nèi)，最大比生長(zhǎng)速率隨溫度的升高而增大，呈良好線性關(guān)系。方程擬合的決定系數(shù)R2為0.911。得出的理論最低生長(zhǎng)溫度為2.4℃，實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)了5℃下的奶油中的金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，基本處于不增長(zhǎng)或是負(fù)增長(zhǎng)狀態(tài)，所以這個(gè)理論最低生長(zhǎng)溫度是有一定的參考意義。

2.3 模型的驗(yàn)證

表4是，比生長(zhǎng)速率的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的殘差平方和(RSS)、平方根誤差(RMSE)、準(zhǔn)確性因子(Af)、偏差因子(Bf)。

表4 比生長(zhǎng)速率的預(yù)測(cè)值與觀測(cè)值的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Table 4 Statistic analysis of μmbetween predicted value and observed value

通過(guò)表4可以得出，二級(jí)模型R2值大于0.92，同時(shí)殘差平方和值只有0.001，這就表明平方根模型可以很好的擬合溫度對(duì)最大比生長(zhǎng)速率的影響，通過(guò)比較最大比生長(zhǎng)速率的預(yù)測(cè)值和觀測(cè)值，得出Af、Bf的值都很接近1，說(shuō)明擬合值和觀測(cè)值都很接近，該模型的擬合度較好，適合預(yù)測(cè)奶油中的金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。

在15～36℃這溫度范圍內(nèi)，分別取了28℃和33℃，在將溫度代入平方根方程中，得到的最大比生長(zhǎng)速率與實(shí)驗(yàn)測(cè)得最大比生長(zhǎng)速率很接近。在28℃溫度條件下μm預(yù)測(cè)值為0.131，實(shí)測(cè)值為0.123；在33℃溫度條件下μm預(yù)測(cè)值為0.189，實(shí)測(cè)值為0.191。可以看出預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值非常的接近，因此這個(gè)模型是值得信賴(lài)的。

3 討論

用于建立微生物模型的數(shù)據(jù)收集方式主要有三種[21,22]：一是實(shí)驗(yàn)室的肉湯液體培養(yǎng)基上接種、培養(yǎng)、測(cè)定。目前，大部分的模型都是基于肉湯液體培養(yǎng)基上建立起來(lái)的，例如PMP（Pathogen modeling program）[23]中所有的模型都是基于液體培養(yǎng)基，用液體培養(yǎng)基建立模型，雖然方便、快捷、測(cè)定數(shù)值精確。但是不同食品的營(yíng)養(yǎng)成分、組成成分不同，所以生長(zhǎng)情況不同，預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際結(jié)果會(huì)有很大的誤差，因此基于肉湯培養(yǎng)基建立的金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)模型不能很好的描述攪打奶油中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)；二是通過(guò)測(cè)定自然污染的原料食品的菌數(shù)變化來(lái)建立模型。自然污染的食品所受污染的微生物種類(lèi)不固定，微生物初始菌不易控制，菌間的相互作用就更復(fù)雜；三是向原料食品上接種特定微生物來(lái)獲得數(shù)據(jù)從而建立模型，這種方法雖然操作繁瑣，菌數(shù)測(cè)定精確度不如液體培養(yǎng)基，但可以考察食品原料組織對(duì)特定微生物生長(zhǎng)的影響，所以建立的模型能很好的預(yù)測(cè)特定微生物在實(shí)際食品上的生長(zhǎng)。本研究采用了第三種方法，向無(wú)菌攪打奶油中直接接種活化好的金黃色葡萄球菌，在密封的大燒杯中進(jìn)行培養(yǎng)和測(cè)定，并驗(yàn)證該數(shù)學(xué)模型用于預(yù)測(cè)金黃色葡萄球菌在攪打奶油中生長(zhǎng)的有效性。

4 結(jié)論

影響微生物生長(zhǎng)的因素很多，如pH，Aw以及生物保鮮劑等，但是對(duì)于攪打奶油中的金黃色葡萄球菌來(lái)說(shuō)，溫度是最大的影響因素，因此本課題選擇溫度作為主要因素來(lái)研究。本實(shí)驗(yàn)研究了攪打奶油中金黃色葡萄球菌在不同溫度下的生長(zhǎng)規(guī)律，實(shí)驗(yàn)選定15±1℃、20±1℃、25±1℃、30±1℃、36±1℃這5個(gè)溫度。分別以修正的Logistic、修正的Gompertz、和Baranyi模型建立了金黃色葡萄球菌在不同溫度下的一級(jí)模型，通過(guò)比較三個(gè)模型的R2和μm，得出Baranyi模型的擬合效果更好，通過(guò)Baranyi生長(zhǎng)曲線可以得出，在15～36℃內(nèi)，最大比生長(zhǎng)速率隨著溫度的升高而增大。通過(guò)15～36℃恒溫下的攪打奶油中金黃色葡萄球菌的Baranyi生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型，建立了在15～36℃恒溫儲(chǔ)藏條件下攪打奶油中金黃色葡萄球菌最大比生長(zhǎng)速率與溫度關(guān)系的有效二級(jí)模型，為使用者提供能精確預(yù)測(cè)金黃色葡萄球菌在攪打奶油流通或食用過(guò)程中的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)工具。

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Establishment of Growth Model of Staphylococcus aureus in Whipping Cream

LAI Zhang-lin1,LI Bai-lin1,OU Jie1*,YAN Wei-ling2
1.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China
2.Shanghai Food Research Institute,Shanghai 200235,China

In dairy research many study about primary and secondary models of Staphylococcus aureus growth focus on the milk,but very few report related with the S.aureus growth on whipping cream.In order to well understand the S.aureus growth in whipping cream and provide data support for the risk assessment of S.aureus,a S.aureus strain produce enterotoxin A was chosen in this study and S.aureus growth curves in whipping cream at 15℃,20℃,25℃,30℃and 36℃were obtained.The modified Gompertz,modified Logistic and Baranyi models were applied to fit the growth curves as primary models by Origin 8.0 software and DMFit software.The root-squaring model was used to fit secondary model which describing the relationship between the maximum growth rate with temperature.The results showed that the Baranyi model was the best to fit the S.aureus growth in whipping cream as primary model and the values from the Baranyi model could build the root-squaring model with R2as 0.92,the accurate factor(Af)and the deviation factor(Bf)were around 1.This secondary model from this study can be used to predict the growth of S.aureus in whipping cream under 15℃～36℃.

Whipping cream;temperature;Staphylococcus aureus;growth model

TS252.52

A

1000-2324(2015)03-0341-06

2013-05-01

2013-05-11

上海市科委應(yīng)用技術(shù)開(kāi)發(fā)專(zhuān)項(xiàng)資金(2013-116）、(2014-110)

賴(lài)章林(1990-),男,碩士研究生,研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué).E-mail:974897861@qq.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:jou@shou.edu.cn