青花菜綠雄80游離小孢子培養(yǎng)因素研究

李江渝，俞金龍，2，巫水欽，趙 輝，梁 娟，熊 琴，俞 洋

(1.浙江美之奧種業(yè)有限公司,浙江嘉興 314000;2.金華市農(nóng)業(yè)科學研究院,浙江金華 321000)

青花菜綠雄80游離小孢子培養(yǎng)因素研究

李江渝1，俞金龍1，2，巫水欽1，趙 輝1，梁 娟1，熊 琴1，俞 洋1

(1.浙江美之奧種業(yè)有限公司,浙江嘉興 314000;2.金華市農(nóng)業(yè)科學研究院,浙江金華 321000)

以大田生長的青花菜綠雄80為供試材料,研究影響小孢子培養(yǎng)因素。結(jié)果表明,材料在4℃預(yù)處理24 h,經(jīng)B5培養(yǎng)基抽提后,以17%蔗糖的NLN培養(yǎng)基添加0.1 mg·mL-1的AC,33℃熱激1 d,放入25℃暗培養(yǎng),形成細胞團后50 r·min-1振蕩培養(yǎng),可大大提高出胚率。

青花菜;預(yù)處理;活性炭;小孢子培養(yǎng)

文獻著錄格式:李江渝,俞金龍,巫水欽,等.青花菜綠雄80游離小孢子培養(yǎng)因素研究[J].浙江農(nóng)業(yè)科學,2015,56(5):681-684.

DOI 10.16178/j.issn.0528-9017.20150537

自從1982年Lichter在蕓薹屬植物游離小孢子技術(shù)取得突破后,該技術(shù)現(xiàn)已在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用。其中以加拿大、英國、瑞典、挪威、日本等多家所獲得的成果尤為突出。1988年,Chuong等[1]利用小孢子技術(shù)隊埃塞俄比亞芥藍的研究中成功獲得了再生植株。Takahat等[2],1991年通過對青花菜和芥藍等材料的研究,成功地獲得了小孢子和再生植株。在國內(nèi),由于小孢子技術(shù)起步較晚,但發(fā)展迅猛,并取得了可喜的成果[3]。李光濤等[4]在對紫菜苔的研究中首次獲得了游離小孢子再生植株。雖然在許多材料上已經(jīng)成功獲得了小孢子材料,但其獲得頻率不高,這一難題逐漸成為人們研究的熱點。本研究旨提高青花菜小孢子成胚頻率,為青花菜的遺傳育種研究提供新的育種手段。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗于2014年3月至2014年7月在浙江美之奧種業(yè)有限公司作物分子設(shè)計育種中心進行。供試的綠雄80材料來源于日本時田公司引進品種。

1.2 游離小孢子培養(yǎng)實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基

提取液(B5):不含激素的B5培養(yǎng)基(Gamborg etal,1968),13%蔗糖(B5-13),pH值5.80～5.95,121℃高壓滅菌。

誘導基本培養(yǎng)基(NLN):購買的商品NLN干粉的培養(yǎng)(Liehter,1982),17%蔗糖(NLN-17) pH值5.85～5.95,0.22 μm濾膜過濾除菌,置4℃冰箱備用。

1.2.2 花蕾大小的選擇

采集綠雄80新鮮花蕾,用解剖針挑取花藥與載玻片上,于顯微鏡下DAPI染色鏡檢,選擇單核靠邊期至雙核早期的花蕾作為試驗材料。

1.2.3 小孢子的分離純化

開花期采集健壯植株上長2～5 mm(小孢子發(fā)育處于單核靠邊期至雙核早期)的花蕾,蒸餾水沖洗3次,經(jīng)70%乙醇溶液表面消毒30 s,再用2%NaClO溶液滅菌8 min,無菌水洗滌3次,每次5 min。瀝干水分后,在B5液體洗滌培養(yǎng)基中用玻璃棒碾壓花蕾,擠出小孢子。小孢子懸浮液經(jīng)孔徑40 μm的尼龍網(wǎng)過濾后,800 r·min-1離心5 min;棄上清液,沉淀物加5 mL B5洗滌培養(yǎng)基,搖勻,800 r·min-1離心3 min;棄上清液,所得沉淀物即為純化小孢子。

1.2.4 小孢子的培養(yǎng)

將純化后的小孢子加入NLN培養(yǎng)基,在顯微鏡下鏡檢并稀釋到小孢子濃度為1×105個分裝到6 cm的無菌培養(yǎng)皿中,用Parafilm膜封口。在33℃恒溫培養(yǎng)箱中熱激處理一段時間后,再轉(zhuǎn)至25℃下靜置暗培養(yǎng),待出現(xiàn)肉眼可見的胚狀體后,置于搖床上振蕩培養(yǎng)。

1.2.5 小孢子胚誘導率研究

影響小孢子成胚的因素很多,本試驗從材料預(yù)處理、活性炭培養(yǎng)、高溫熱激時間這幾個方面進行了研究。實驗按前述方法進行分離純化懸浮培養(yǎng),4周后統(tǒng)計胚狀體誘導率,胚誘導率以平均每皿產(chǎn)生胚狀體數(shù)計算。

4℃低溫預(yù)處理。取生長旺盛的花序放入4℃冰箱處理24,48 h后,按1.2.3節(jié)的方法獲得游離小孢子,于33℃熱激24 h,之后轉(zhuǎn)入25℃暗培養(yǎng)。

熱激時間實驗。以新鮮材料,分別設(shè)4℃冰箱處理24,48 h后,及未低溫預(yù)處理為對照,按1.2.3節(jié)的方法獲得游離小孢子,于33℃熱激0, 24,30,45,48 h,然后轉(zhuǎn)入25℃暗培養(yǎng)。

活性炭實驗。以新鮮材料以及4℃冰箱處理24,48 h,按1.2.3節(jié)的方法獲得游離小孢子后,分加入不同以下濃度的活性炭0.050,0.075, 0.100,0.150,0.175,0.200 mg·mL-1,于33℃熱激24 h,之后轉(zhuǎn)入25℃暗培養(yǎng)。

1.3 胚狀體再生植株

胚狀體再生植株基本培養(yǎng)基:1)MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂;2)B5+3%蔗糖+0.8%瓊脂。

1.4 再生植株生根實驗

以MS添加0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg·L-1的NAA誘導再生植株生根的影響。

1.5 再生植株倍性檢測

將培養(yǎng)基中的小苗移出到室外煉苗后,定植到田間,待新的葉片產(chǎn)生后,取再生植株幼嫩葉片,利用流式細胞儀采用Jaroslav[5]的方法檢測其倍性。

2 結(jié)果與分析

采用擠壓法獲得的游離小孢子效率高,且污染率低,選擇合適的時期的小孢子是誘導成胚的關(guān)鍵。選擇單核靠邊期至雙核早期的材料,能成功觀察到游離小孢子經(jīng)過處理后有膨大現(xiàn)象(圖1和2),其他時期的小孢子則基本無反應(yīng)。

圖1 小孢子DAPI染色

圖2 小孢子發(fā)育途徑

通過對小孢子4℃預(yù)處理以及結(jié)合熱激時間研究,結(jié)果(圖3)表明,單一通過4℃預(yù)處理的小孢子無法形成胚狀體,而結(jié)合熱激24 h后的小孢子材料,能形成少量的胚。這說明熱激能夠促進小孢子的胚性轉(zhuǎn)化,從而誘導出胚。

通過4℃預(yù)處理24 h結(jié)合33℃熱激處理24 h,然后結(jié)合添加活性炭0.1 mg·mL-1,能夠形成大量的胚,出胚率達到平均每皿60個(圖4)。說明合適濃度的活性炭有利于促進小孢子成胚,提高出胚率。

圖3 預(yù)處理結(jié)合熱激處理效果

圖4 預(yù)處理結(jié)合熱激添加活性炭處理效果

通過對2種再生培養(yǎng)基的對比,結(jié)果(圖5)表明:MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂效果較好,成苗率高,且褐化較少,而B5+3%蔗糖+0.8%瓊脂容易褐化,難成苗。這說明MS培養(yǎng)基營養(yǎng)元素比B5效果更好,更適合誘導其再生成苗。

圖5 不同培養(yǎng)基誘導胚狀體再生成苗

通過不同濃度的NAA誘導再生植株生根,結(jié)果(圖6)表明,0.3 mg·L-1的NAA生根效果最好,且植株健壯。

圖6 不同濃度NAA誘導生根

通過流式細胞儀對再生植株植物葉片細胞進行倍性鑒定,以正常種子萌發(fā)的植株葉片葉肉細胞為對照。結(jié)果(圖7)表明,測定的60份材料中,其中單倍體材料占10%,四倍體材料占5%,混倍體材料占5%,二倍體材料占80%。檢測結(jié)果中二倍體材料占的比例大,說明小孢子再培養(yǎng)過程中發(fā)生了自然加倍現(xiàn)象,這結(jié)果與許多學者研究結(jié)果大致一致。

3 小結(jié)和討論

圖7 不同倍性青花菜小孢子植株葉片細胞核DNA相對含量曲線

本文在研究游離小孢子培養(yǎng)時,發(fā)現(xiàn)花蕾大小的選擇是能否成功誘導出小孢子胚的前提條件。選擇合適的花蕾(小孢子處于單核靠邊期或雙核早期),通過預(yù)處理后,能明顯觀察到小孢子膨大。而選擇的花蕾過小或者過大,經(jīng)過預(yù)處理后,均不能觀察到小孢子有膨大現(xiàn)象。小孢子經(jīng)熱激處理后能否膨大,是小孢子能否分化成胚狀體的先決條件[6-9]。通過低溫預(yù)處理與熱激處理結(jié)合,可以使本身無法成胚的材料獲得少量的胚狀體,低溫及熱激處理能夠誘導小孢子的胚性轉(zhuǎn)化,從而誘導成胚,而單一的低溫或者熱激處理無法形成胚。添加合適濃度的外源活性炭可以大大促進成胚率,而高濃度的活性炭能抑制成胚,這與韓陽等所報道的結(jié)果大致相同[10]。通過對再生植株的倍性鑒定,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)為二倍體材料,少數(shù)為單倍體、嵌合體及四倍體材料,這很有可能是小孢子培養(yǎng)時發(fā)生了自然加倍所導致。與Chen等的研究結(jié)果大體一致[11]。青花菜小孢子培養(yǎng)過程中的自然加倍現(xiàn)象,省去了人工加倍步驟,為創(chuàng)制DH系提供了便利,然而其具體是在小孢子培養(yǎng)時期自然加倍,還是在胚狀體再生過程中由愈傷組織自然加倍而來的,還有待于進一步研究。

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(責任編輯：張 韻)

S 635

A

0528-9017(2015)05-0681-04

2015-03-27

李江渝(1985-),重慶豐都人,碩士,主要從事十字花科小孢子培養(yǎng)及育種工作,E-mail:182202833@qq.com。