大黃素對重癥急性胰腺炎腸黏膜屏障的保護作用及機制

陳霞，趙宏賢，王巧稚，李昌平

大黃素對重癥急性胰腺炎腸黏膜屏障的保護作用及機制

陳霞1，趙宏賢2，王巧稚2，李昌平1

目的從細胞凋亡方面，探討大黃素對重癥急性胰腺炎（SAP）腸黏膜功能障礙的保護作用及相關作用機制。方法SD大鼠30只，按隨機數字表法分為假手術組、SAP組和大黃素組。采用胰管逆行注射3%牛磺膽酸鈉溶液制作SAP模型，大黃素組制作SAP模型1 h后給予大黃素25 mg/kg腹腔注射，2 h后重復1次。TUNEL法檢測回腸黏膜細胞凋亡；免疫組化法檢測回腸黏膜細胞GRP78蛋白表達。結果與假手術組相比，SAP組大鼠腸黏膜細胞凋亡及GRP78蛋白表達明顯增加（P＜0.05）；與SAP組相比較，大黃素組大鼠腸黏膜細胞凋亡減少（P＜0.05），GRP78蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。結論大黃素可減少SAP時的腸黏膜細胞凋亡，保護腸黏膜屏障，但這種保護作用似乎并未涉及到內質網應激途徑。

胰腺炎，急性壞死性；急性病；腸黏膜；大黃素；細胞凋亡；大鼠，Sprague-Dawley；重癥急性胰腺炎；葡萄糖調節蛋白78

腸黏膜屏障在維護腸功能中起著重要作用。腸黏膜屏障功能障礙（IBFD）是嚴重消化系統疾病的常見表現之一，與重癥急性胰腺炎（SAP）病情嚴重程度密切相關［1-2］。SAP時IBFD是多因素共同作用下的病理生理過程。近期研究發現，SAP時腸黏膜上皮細胞凋亡增加，而腸黏膜細胞凋亡的抑制可改善腸黏膜屏障損傷，并減輕SAP時的內毒素血癥［3-4］。大黃在臨床中常單獨或聯合用于SAP腸功能障礙的治療，然而大黃對SAP腸功能障礙防治作用的相關機制尚不完全清楚。大黃素是大黃的主要有效成分之一。本課題擬建立SAP大鼠模型，從細胞凋亡著手，探討大黃素對SAP時腸黏膜屏障功能的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料健康純系清潔級雄性SD大鼠30只，體質量200～250 g，由瀘州醫學院動物科提供；牛磺膽酸鈉購于美國Sigma公司；TUNEL試劑盒（瑞典Roche Diagnostics公司）；葡萄糖調節蛋白78（glucose regulated protein，GRP78）抗體購于美國Bioword公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及SAP造模SD大鼠適應性喂養1周后，采用隨機數字表法分為3組，每組10只。（1）假手術組：麻醉后開腹，胰管逆行注射生理鹽水1 mL/kg，縫合腹腔。（2）SAP組：胰管逆行注射3%牛磺膽酸鈉溶液1 mL/kg。（3）大黃素組：胰管逆行注射3%牛磺膽酸鈉溶液1 mL/kg，1 h后腹腔內注射大黃素25 mg/kg，2 h后重復注射1次。所有動物術后均給予皮下注射生理鹽水5 mL以補充血容量。自由飲水、進食。

1.2.2 病理學觀察造模24 h后取胰腺組織，將胰腺置于10%中性甲醛中固定，行常規病理HE染色檢查。光鏡下觀察胰腺病理改變。

1.2.3 TUNEL法檢測細胞凋亡取回腸組織，常規石蠟切片制作，TUNEL法檢測腸黏膜細胞凋亡。操作步驟參照文獻［5］。細胞核棕黃（褐）色為陽性結果。每組取10個標本，顯微數碼照相，image-proplus 5.0軟件計算各組細胞凋亡率。

1.2.4 免疫組化法檢測GRP78蛋白的表達取回腸組織4%多聚甲醛固定，常規脫水石蠟包埋，切片，免疫組化操作步驟參考說明書。每組取10個標本，每個標本3張切片，顯微數碼照相，image-proplus5.0軟件計算陽性細胞百分率。

1.3 統計學方法采用SPSS 14.0進行統計學處理。計量資料以均數±標準差（）表示，多組間均數比較采用方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SAP大鼠模型制備結果肉眼可見SAP組和大黃素組大鼠胰腺形態輪廓不規則，局部彌漫性水腫，被膜下可見出血斑，部分大鼠腹腔內可見血性腹水。SAP組和大黃素組大鼠胰腺組織切片可見胰腺大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，充填于腺泡之間，間質內部分血管壁壞死、出血，腺泡數量減少、雜亂，證明SAP大鼠模型制備成功，見圖1。

2.2 細胞凋亡檢測各組回腸黏膜細胞都存在凋亡，見圖2。3組間凋亡率比較差異有統計學意義（F=47.794，P＜0.05），與假手術組（8.10%±1.62%）相比，SAP組（23.14%±3.56%）大鼠腸黏膜細胞凋亡明顯增加（P＜0.05）。大黃素組（12.35%±4.32%）較SAP組黏膜細胞凋亡減少（P＜0.05）。

Fig.2TUNEL assay of ileum section which was counterstained with hematoxylin（DAB，×400）圖2 TUNEL法檢測各組大鼠回腸黏膜細胞凋亡（DAB染色，×400）

2.3 GRP78蛋白表達GRP78蛋白的陽性表達主要定位于細胞漿內，細胞膜上也可見少量表達，見圖3。3組間陽性細胞表達率比較差異有統計學意義（F=41.841，P＜0.05）。與假手術組（15.62%±2.25%）相比，SAP組（28.02%±3.24%）腸黏膜細胞GRP78蛋白的表達明顯增加（P＜0.05）。大黃素組（25.43%± 3.45%）與SAP組GRP78蛋白的表達差異無統計學意義（P＞0.05）。

Fig.3Immunohistochemistry staining of GRP78 protein in ileal epithelium sction（DAB，×400）圖3 各組大鼠回腸黏膜細胞GRP78蛋白的表達（DAB染色，×400）

3 討論

腸道除消化吸收功能外，還對腸道細菌及其毒素具有重要的屏障作用。腸黏膜屏障由機械屏障、微生物屏障、免疫屏障以及化學屏障共同構成。作為機體內最大的細菌庫和毒素庫，腸黏膜屏障功能破壞后可導致全身炎癥反應綜合征和多器官功能不全。SAP時不可避免出現腸黏膜通透性增加，黏膜屏障功能受損。

SAP時腸黏膜屏障功能障礙的發生機制尚不完全清楚，可能與炎癥介質與細胞因子、微循環障礙、腸動力障礙、免疫功能障礙等因素有關，而上述因素最終都要通過作用于腸黏膜細胞，從而導致腸黏膜屏障損傷的發生，腸黏膜細胞損傷與修復是SAP時腸黏膜屏障功能障礙發生與轉歸的核心環節。本研究中，SAP大鼠腸黏膜細胞凋亡較假手術組明顯增多，與既往的研究一致［3，5］。腸黏膜上皮細胞增生和凋亡之間的平衡可影響腸黏膜屏障功能。SAP時腸上皮細胞凋亡過度，修復與再生受阻，可造成腸黏膜屏障功能障礙。本研究同時發現，給予大黃素干預后SAP大鼠腸黏膜細胞凋亡明顯減少。大黃是臨床中用于SAP腸道衰竭的常用藥物，并有較好的腸道保護作用。本研究結果提示大黃素可通過減少腸黏膜細胞凋亡來起到保護SAP時的腸道損傷。

內質網應激（ER stress，ERS）是近年來發現的十分重要的介導細胞凋亡的途徑之一［6］。內質網是真核細胞中調節蛋白質合成、折疊與分泌的重要細胞器，調控細胞對應激的反應等。細胞受到環境毒物、缺氧、病毒、紫外線等刺激時內質網出現的腔內錯誤折疊、未折疊蛋白聚集以及Ca2+平衡紊亂等，可引起內質網功能紊亂，稱為ERS。ERS可促進內質網發生一系列生理變化，處理蓄積在內質網腔內的錯誤折疊或未折疊蛋白，從而維持細胞的正常功能。但是過度的ERS可引起細胞凋亡，ERS信號由促生存向促凋亡轉換。GRP78屬于熱休克蛋白（HSP70）家族，是ERS的主要調節器。GRP78通過與內質網膜3種跨膜蛋白解離與結合來啟動或關閉ERS，因此GRP78作為內質網功能的中心調節者決定著細胞“生存”或“死亡”的命運［7］。GRP78的過表達常提示ERS的發生，并且對ERS信號傳導起著關鍵作用。本研究結果顯示，與假手術組相比，SAP組大鼠腸黏膜細胞GRP78蛋白表達增加，提示SAP大鼠腸黏膜細胞存在ERS。但是與筆者預期不同的是，給予了大黃素治療的SAP大鼠腸黏膜細胞GRP78蛋白表達與SAP組相比差異并無統計學意義，顯示大黃素對ERS并無調節作用。因此推測大黃素減少SAP大鼠腸黏膜細胞凋亡的作用似乎并不依賴ERS途徑。

綜上所述，腸黏膜細胞凋亡增加參與了SAP腸黏膜屏障功能障礙。大黃素可減少SAP時的腸黏膜細胞凋亡，保護腸黏膜屏障。大黃素的這種腸道保護作用似乎與ERS途徑無關，尚需進一步探索其他保護機制，為大黃在臨床治療SAP腸功能障礙提供更堅實的理論和實驗依據。

［1］Capurso G，Zerboni G，Signoretti M，et al.Role of the gut barrier in acute pancreatitis［J］.J Clin Gastroenterol，2012，46 Suppl:S46-51.doi:10.1097/MCG.0b013e3182652096.

［2］Tian R，Tan JT，Wang RL，et al.The role of intestinal mucosa oxidative stress in gut barrier dysfunction of severe acute pancreatitis［J］. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2013，17（3）:349-355.

［3］Chen X，Zhao HX，Fu XS，et al.Glucagonlike peptide 2 protects intestinal barrier in severe acute pancreatitis through regulating intestinal epithelial cell proliferation and apoptosis［J］.Pancreas，2012，41:1080-1085.doi:10.1097/MPA.0b013e31824966b0.

［4］Han T，Li XL，Cai DL，et al.Effects of glutamine-supplemented enteral or parenteral nutrition on apoptosis of intestinal mucosal cells in rats with severe acute pancreatitis［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2013，17（11）:1529-1535.

［5］Zhao HX，Yang XH，Li CP，et al.Small intestinal smooth muscle cell apoptosis in rats with severe acute pancreatitis［J］.World Chinese Journal of Digestology，2014，22（28）:4231-4236.［趙宏賢，楊曉紅，李昌平，等.重癥急性胰腺炎對大鼠小腸平滑肌細胞凋亡的影響［J］.世界華人消化雜志，2014，22（28）:4231-4236］.doi: 10.11569/wcjd.v22.i28.4231.

［6］Fu XL，Gao DS.Endoplasmic reticulum proteins quality control and the unfolded protein response:the regulative mechanism of organisms against stress injuries［J］.Biofactors，2014，40（6）:569-585.doi: 10.1002/biof.1194.

［7］Zhu G，Lee AS.Role of the unfolded protein response，GRP78 and GRP94 in organ homeostasis［J］.J Cell Physiol，2014，230（7）:1413-1420.doi:10.1002/jcp.24923.

（2015-04-08收稿 2015-08-06修回）

（本文編輯 魏杰）

Protective roles of Emodin in the intestinal mucosal layer of rats with severe acute pancreatitis

CHEN Xia1，ZHAO Hongxian2，WANG Qiaozhi2，LI Changping1
1 Department of Gastroenterology of Affiliated hospital，Luzhou 646000，China；2 Department of Histology and Embryology，Sichuan Medical University

ObjectiveTo explore the protective roles of Emodin in the intestinal mucosal lay of rats with severe acute pancreatitis（SAP）and its mechanism.MethodsSD rats（n=30）were divided into 3 groups:sham operation group，SAP group and Emodin group（SAP rats treated with Emodin）.The SAP rat models were established via retrograde injection of 3% sodium taurocholate to pancreatic duct.Rats in Emodin group were peritoneally injected with Emodin（2.5 mg/100 g）at both 1 hour and 3 hour after sodium taurocholate injection.Apoptosis of intestinal epithelial cell was detected by TUNEL analysis.The expression of glucose-regulated protein78（GRP78）protein was assessed by immunohistochemistry.ResultsCompared with sham operation group，apoptosis in intestinal epithelial cells and the expression of GRP78 protein were increased significantly in SAP group（P＜0.05）.Emodin treatment reduced AP-induced mucosal intestinal epithelial cell apoptosis（P＜0.05）.But there is no significant difference of GRP78 expression between SAP group and Emodin group（P＞0.05）. ConclusionEmodin has a protective effect on intestinal layer in rats with SAP through inhibiting intestinal epithelial cell apoptosis.However，ER stress is not likely to be involved in this protective effect.

pancreatitis，acute necrotizing；acute disease；intestinal mucosa；Emodin；apoptosis；rats，Sprague-Dawley；severe acute pancreatitis；glucose-regulated protein78

R576.1

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.12.014

四川省衛生廳科研項目（130369）

1瀘州醫學院附屬醫院消化內科（郵編646000）；2四川醫科大學組織胚胎學教研室

陳霞（1978），女，副主任醫師，碩士，主要從事腸黏膜屏障方面研究