Exendin-4對大鼠脊髓損傷后氧化應激和神經細胞凋亡的影響

趙興長，李昊天，王繼權，孫平，褚鑫，呂剛，范仲凱

實驗研究

Exendin-4對大鼠脊髓損傷后氧化應激和神經細胞凋亡的影響

趙興長，李昊天，王繼權，孫平，褚鑫，呂剛，范仲凱△

目的研究Exendin-4對大鼠脊髓損傷后氧化應激和神經細胞凋亡的作用。方法成年雄性SD大鼠36只（體質量200～250 g）隨機分為3組（n=12）：假手術組（Sham組）、單純脊髓損傷組（SCI組）、Exendin-4組（Ex-4組）。Sham組只暴露脊髓，不打擊；SCI組和Ex-4組均采用Allen′s重物打擊法制作脊髓損傷模型；Ex-4組在脊髓損傷后立即腹腔內注射Exendin-4溶液，劑量10μg/只；SCI組和Sham組均注射等體積生理鹽水。在24 h后檢測各組脊髓組織中丙二醛（MDA）含量和過氧化氫酶（CAT）活性，TUNEL法檢測神經細胞凋亡情況，Western blot檢測caspase-9和凋亡誘導因子（AIF）的表達情況。結果與Sham組相比，SCI組脊髓組織中的MDA含量明顯增加，caspase-9和AIF表達水平明顯增加，神經細胞凋亡比例明顯升高，CAT活性明顯降低（P＜0.01）。與SCI組相比，Ex-4組脊髓組織中MDA含量明顯降低，caspase-9和AIF表達水平明顯降低，神經細胞凋亡比例明顯降低，CAT活性明顯升高（P＜0.01）。結論大鼠脊髓損傷后，Exendin-4可通過減輕氧化損傷抑制神經細胞凋亡。

脊髓損傷；氧化性應激；細胞凋亡；胰高血糖素樣肽1；大鼠，Sprague-Dawley；Exendin-4

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種嚴重的創傷性疾病，其治療與康復一直是研究熱點。脊髓損傷分為原發損傷和繼發損傷兩個階段，原發損傷主要是機械性組織損傷和急性細胞壞死，繼發性損傷則包括氧化應激反應、炎癥反應、鈣離子調動等一系列病理生理過程。其中，氧化應激是脊髓損傷后神經細胞凋亡和功能紊亂的重要誘導因素［1-2］。因此，脊髓損傷后減輕氧化損傷成為治療的關鍵。胰

高血糖素樣肽-1（GLP-1）是由小腸L細胞分泌的一種血糖依賴性促胰島激素［3］，臨床上已經用于治療2型糖尿病［4］。但GLP-1在體內半衰期短，易被降解而失去生物學活性［5］，其應用受到明顯限制。Exendin-4是一種長效GLP-1受體激動劑［6］，已經被美國食品藥品監督管理局（FDA）批準用于2型糖尿病的治療。有研究表明，Exendin-4對心肌缺血再灌注損傷［7］和周圍神經損傷具有治療作用［8］。但目前尚鮮見Exendin-4作用于脊髓損傷的研究。本研究旨在觀察Exendin-4對脊髓損傷后氧化應激和神經細胞凋亡的影響，初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組SPF級健康成年雄性SD大鼠36只（遼寧醫學院實驗動物中心提供），體質量200～250 g。應用隨機數字表法將大鼠分為3組，每組12只。SCI組：采用Allen′s重物打擊法制作脊髓損傷模型。對照組（Sham組）：暴露脊髓后不打擊，其他手術操作同SCI組。Exendin-4（Ex-4）組：制備脊髓損傷模型后立刻腹腔內注射Exendin-4溶液（Exendin-4溶于無菌生理鹽水），劑量為10μg/只，SCI組和Sham組均注射等體積生理鹽水。

1.2 主要試劑與儀器Exendin-4（美國sigma公司）；丙二醛（MDA）測定試劑盒、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；RIPA裂解液（強）、BCA蛋白濃度測定試劑盒和超敏ECL化學發光試劑盒均購自碧云天生物技術研究所；In Situ Cell Death Detection Kit，TMR red（Roche公司）；兔抗鼠凋亡誘導因子（AIF）一抗、兔抗鼠caspase-9一抗、小鼠抗大鼠β-actin一抗、山羊抗兔IgG二抗（ab175773）和山羊抗大鼠IgG二抗（ab175751）均購自美國abcam公司。電泳儀和酶標儀（Bio-Rad公司）；超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；HC-3018高速冷凍離心機（科大創新股份有限公司）；BT100-1L蠕動泵（保定蘭格恒流泵有限公司）；冰凍切片機和熒光顯微鏡DMI4000B（Leica公司）；721分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）。

1.3 模型制備大鼠腹腔內注射10%水合氯醛3 mL/kg，充分麻醉后，將大鼠固定于手術臺，常規消毒后背皮膚。定位T9棘突，以此為中心逐層切開皮膚、皮下組織、肌層，用咬骨鉗去除T9、T10棘突及椎板，充分暴露脊髓。參照Allen′s法重物打擊脊髓，打擊后脊髓充血腫脹，大鼠雙后肢痙攣性抽動，尾巴痙攣性擺動，視為模型制備成功。再次消毒切口后逐層縫合皮膚，分籠飼養，自由攝取食物和水，間斷按摩膀胱協助排尿。

1.4 檢測樣品制備各組大鼠接受預處理24 h后，取出脊髓組織用于制備蛋白樣品，參照RIPA裂解液（強）說明書進行操作：將新鮮脊髓組織剪碎，加入RIPA裂解液和苯甲基磺酰氟（PMSF）并混勻，用超聲波細胞粉碎機粉碎30 s，以上操作在冰浴條件下進行，將混懸液置于高速冰凍離心機4℃、12 000×g離心5 min，取上清液備用。

1.5 MDA和CAT活性檢測將新鮮蛋白樣品按照MDA、 CAT檢測試劑盒使用說明書進行檢測。

1.6 Western blot檢測制備的蛋白樣品按照BCA蛋白濃度測定試劑盒的說明進行檢測，根據標準曲線計算出樣品的蛋白濃度。將適當比例的蛋白樣品、TBS、RSB混合煮沸，冷卻至室溫后按照每個孔道30μg蛋白量加樣品，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；然后轉印至PVDF膜，封閉液室溫浸泡1 h，分別用caspase-9一抗（1∶500）、β-actin一抗（1∶1 000）和AIF一抗（1∶1 000）浸泡PVDF膜，4℃搖床孵育過夜；洗膜液洗膜3次，5 min/次；二抗室溫孵育1 h，洗膜液洗膜3次，5 min/次；超敏ECL化學發光試劑盒中Beyo ECL Plus A液和Beyo ECL Plus B液等體積混合后滴加于PVDF膜，曝光顯像。用Image J軟件分析圖像，計算出caspase-9和AIF蛋白相對表達量（AIF/β-actin，caspase-9/β-actin）。

1.7 TUNEL檢測大鼠接受處理條件24 h后，腹腔內注射10%水合氯醛3 mL/kg，充分麻醉后開胸暴露心臟；將蠕動泵細針穿入主動脈，止血鉗固定；依次用生理鹽水和4%多聚甲醛溶液灌注20 min；固定后迅速取出T9、T10節段脊髓組織，4%多聚甲醛溶液4℃固定24 h，30%蔗糖溶液浸泡脫水24 h。將處理后的組織在-20℃條件下用OCT包埋，冰凍切片機連續切取組織切片，厚度為5 μm。按照TUNEL試劑盒說明書進行染色，在熒光顯微鏡下觀察。在400倍視野下，打擊部位周邊組織切片隨機讀取6個不重疊的區域，觀察并計數TUNEL陽性細胞（胞核呈紅色）和細胞總數（胞核呈藍色），以細胞凋亡比例（紅色細胞數/藍色細胞數）表示神經細胞凋亡情況。

1.8 統計學方法采用SPSS 16.0統計學軟件進行分析，計量數據均采用均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗，Р＜0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MDA含量和CAT活性比較與Sham組相比，SCI組、Ex-4組MDA含量明顯增加而CAT活性明顯降低（P＜0.01）；與SCI組相比，Ex-4組MDA含量明顯降低而CAT活性明顯增加，差異均有統計學意義（P＜0.01），見表1。

Tab.1MDA level and CAT activity in spinal cord in different groups表1 各組脊髓中MDA含量和CAT活性比較（n=6，）

Tab.1MDA level and CAT activity in spinal cord in different groups表1 各組脊髓中MDA含量和CAT活性比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與SCI組比較，P＜0.01；表2同

組別S h a m組S C I組E x -4組F C A T（U / m g）3 . 7 4 5 ± 0 . 3 3 3 1 . 5 6 4 ± 0 . 1 5 5a2 . 4 6 8 ± 0 . 2 0 8ab1 2 1 . 3 0 3＊＊M D A（μ m o l / g）0 . 8 2 1 ± 0 . 0 7 4 2 . 4 7 2 ± 0 . 2 3 0a1 . 4 9 4 ± 0 . 2 8 4ab8 9 . 1 9 4＊＊

2.2 caspase-9和AIF蛋白表達水平比較SCI組caspase-9和AIF蛋白相對表達量較Sham組明顯增加，Ex-4組caspase-9和AIF蛋白相對表達量較

SCI組明顯降低，較Sham組明顯增加，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見圖1、表2。

Fig.1Expressions of caspase-9 and AIF protein shown by Western blot圖1 Western blot檢測caspase-9蛋白和AIF蛋白表達

Tab.2The relative expressions level of caspase-9 and AIF as well as neuronal apoptosis rate表2 caspase-9蛋白和AIF蛋白相對表達水平和神經細胞凋亡比例比較（n=6，）

Tab.2The relative expressions level of caspase-9 and AIF as well as neuronal apoptosis rate表2 caspase-9蛋白和AIF蛋白相對表達水平和神經細胞凋亡比例比較（n=6，）

組別S h a m組S C I組E x -4組F c a s p a s e -9 0 . 6 7 6 ± 0 . 0 5 4 1 . 3 3 4 ± 0 . 1 0 4a1 . 0 2 4 ± 0 . 0 7 3ab1 0 2 . 0 5 3＊＊A I F 0 . 5 8 1 ± 0 . 0 5 2 1 . 2 4 7 ± 0 . 1 0 9a0 . 9 2 8 ± 0 . 0 7 1ab1 0 2 . 8 0 9＊＊神經細胞凋亡比例0 . 0 2 3 ± 0 . 0 1 0 0 . 3 1 4 ± 0 . 0 3 8a0 . 1 9 9 ± 0 . 0 3 9ab1 2 4 . 8 6 9＊＊

2.3 各組神經細胞凋亡結果比較SCI組與Sham組相比，神經細胞凋亡比例明顯增加（P＜0.01），Ex-4組神經細胞凋亡比例明顯低于SCI組而高于Sham組，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見圖2、表2。

Fig.2TUNEL staining in each group（Fluorescence Microscope，×400）圖2 各組TUNEL染色圖像（熒光顯微鏡，×400）

3 討論

脊髓損傷是一種嚴重的外科疾病，影響患者的生存質量甚至導致患者死亡。脊髓損傷分為兩個階段：早期機械性原發損傷和中晚期炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡等一系列繼發性損傷［2］。脊髓損傷后，氧化活性物質大量產生，超過機體的代償能力，氧化損傷與抗氧化損傷的平衡被打破，最終引起神經細胞DNA損傷和蛋白表達異常，產生細胞毒效應，誘導神經細胞凋亡［9-11］。因此，脊髓損傷后減輕氧化損傷對于脊髓損傷的治療具有重要的意義。

GLP-1是一種包含30個氨基酸的腸促激素，由胰高血糖素原基因轉錄、翻譯后加工修飾形成［3］。研究證實，GLP-1對神經系統損傷有保護作用［12］。Exendin-4作為一種長效GLP受體激動劑，已經在臨床上用于治療2型糖尿病［13］。實驗研究表明，Exendin-4能夠抑制氧化應激誘導的胰腺β細胞凋亡［14］，促進神經再生［8］，對腦缺血再灌注損傷具有保護作用［15］。因此，筆者推測Exendin-4對脊髓損傷的治療也有重要意義。

本研究首先檢測氧化損傷，SCI組MDA含量較Sham組明顯增加，Ex-4組MDA含量較SCI組明顯降低；SCI組CAT活性較Sham組明顯降低，Ex-4組CAT活性較SCI明顯升高，與以往研究相同［16］。MDA是脂質過氧化的終產物，其含量直接反映組織氧化損傷的程度；CAT是過氧化物酶系的標志酶，其活性是組織抗氧化能力的重要標志［10］。脊髓損傷后，大量氧化活性物質堆積，超過機體代償能力，氧化損傷加重，抗氧化能力明顯降低。Exendin-4明顯降低脊髓組織中MDA含量、增加抗氧化酶CAT的活性，減輕氧化損傷，促進機體抗氧化能力的恢復。進一步檢測神經細胞凋亡情況，Western blot結果顯示：SCI組凋亡相關蛋白caspase-9和AIF相對表達量較Sham組明顯增加，而Ex-4組caspase-9和AIF相對表達量較SCI組明顯降低。TUNEL結果顯示：SCI組神經細胞凋亡比例明顯高于Sham組，結果同以往研究［9］。Ex-4組神經細胞凋亡比例較SCI組明顯降低。脊髓損傷后，各種刺激因素破壞線粒體膜，通過激活內源性細胞凋亡途徑和非caspase依賴的細胞凋亡途徑誘導神經細胞凋亡。內源性細胞凋亡途徑：線粒體釋放的細胞色素c與凋亡蛋白酶激活因子相互作用，順序激活caspase-9、caspase-3及caspase-7，最終誘導神經細胞凋亡［17］。非caspase依賴的細胞凋亡途徑：線粒體釋放AIF，AIF轉移到細胞核后導致染色體凝集和DNA斷裂，最終誘導神經細胞凋亡［18］。脊髓損傷后腹腔內注射Exendin-4，caspase-9、AIF相對表達量和神經細胞凋亡比例明顯降低，其機制可能是Exendin-4減少過氧化物質的產生，提高機體的抗氧化能力，抑制內源性細胞凋亡途徑和非caspase依賴的細胞凋亡途徑，減少神經細胞凋亡。

綜上所述，大鼠脊髓損傷后，Exendin-4可通過

減輕氧化損傷抑制神經細胞凋亡。本研究只是初步探討了Exendin-4對脊髓損傷的保護作用及機制，今后還需要進一步研究脊髓損傷的機制，探索治療脊髓損傷的新藥物、新方法。

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（2015-06-22收稿 2015-07-30修回）

（本文編輯 李國琪）

Effect of Exendin-4 on oxidative stress and neural apoptosis following spinal cord injury

ZHAO Xingzhang，LI Haotian，WANG Jiquan，SUN Ping，CHU Xin，LYU Gang，FAN Zhongkai△
Department of Orthopedics，First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College，Jinzhou，Liaoning 121001，China△

ObjectiveTo study the effect of Exendin-4 on oxidative stress and neural apoptosis following spinal cord injury（SCI）.MethodsAdult male SD rats，with weight between 200-250 g，were randomly divided into three groups（12 in each group）:Sham group，SCI group and Exendin-4 group（Ex-4 group）.Rats in Sham group achieved spinal cord exposure. SCI group and Ex-4 group were induced according to Allen′s test（using a weight-drop device）.Rats in Ex-4 group were administrated with Exendin-4（10μg/rat）through intraperitoneal injection immediately after establishment of SCI models.Rats in Sham group and SCI group were given the same volume of normal saline solution instead.Level of malondialdehyde（MDA）and the activity of catalase（CAT）were assessed in spinal cord tissues 24 hour after drug administrations.Neural apoptosis was detected by TUNEL staining and the expression levels of caspase-9 and AIF were determined using Western blot.ResultsCompared with Sham group，the levels of MDA，caspase-9 and AIF as well as neuronal apoptosis rate increased obviously，while activity of CAT decreased markedly in SCI group（P＜0.01）.Compared with SCI group，the levels of MDA，caspase-9 and AIF as well as the neuronal apoptosis rate decreased obviously，while activity of CAT increased remarkably in Exendin-4 group（P＜0.01）.ConclusionExendin-4 restrain neural apoptosis following spinal cord injury through relieving oxidative damage.

spinal cord injuries；oxidative stress；apoptosis；glucagon-like peptide 1；rats，Sprague-Dawley；Exendin-4

R681.54

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.12.008

國家自然科學基金資助項目（81272074）；遼寧省高等學校優秀人才支持計劃項目（LJQ2014091）；遼寧醫學院校長基金（AH2014012）

遼寧醫學院附屬第一醫院骨科（郵編121001）

趙興長（1989），男，碩士在讀，主要從事脊髓損傷的機制及修復研究

△通訊作者E-mail:flanzz@163.com