新疆地區哈薩克族慢性阻塞性肺疾病易感性與ADAM33基因多態性的關系

王莎莎，關鍵，王珊，成芳娟，任俠，許西琳，高巖

新疆地區哈薩克族慢性阻塞性肺疾病易感性與ADAM33基因多態性的關系

王莎莎，關鍵△，王珊，成芳娟，任俠，許西琳，高巖

目的探究整合素-金屬蛋白酶33（ADAM33）基因F+1、S2、T1、ST+5位點多態性與新疆地區哈薩克族慢性阻塞性肺疾?。–OPD）易感性的關系。方法選擇193例對照組及197例COPD病例組，提取外周血標本DNA，運用SNaPshot SNP分型技術檢測ADAM33基因各位點多態性。結果病例組與對照組F+1位點的基因型及等位基因頻率分布比較差異有統計學意義（P＜0.05）。病例組中，F+1位點CC、CT、TT 3種基因型肺功能相關指標第1秒用力呼氣容積（FEV1）預計值（%）、FEV1/用力肺活量（FVC）比較差異無統計學意義。病例組與對照組S2、ST+5、T1位點的基因型及等位基因頻率分布比較差異無統計學意義；F+1、S2位點進行單體型分析顯示Hap1（CC）在對照組和病例組分布差異有統計學意義（P＜0.05），且OR＜1，表明此單體型可能降低發生COPD的風險；Hap3（TC）在對照組和病例組分布差異有統計學意義（P＜0.05），且OR＞1，表明此單體型可能增加了COPD發病的風險；Hap2（TG）、Hap4（CG）單體型在2組間分布差異無統計學意義；病例組及對照組T1、ST+5位點3種單體型比較差異無統計學意義。結論ADAM33基因F+1位點多態性可能與新疆哈薩克族人群COPD的發生有關。

肺疾病，慢性阻塞性；ADAM蛋白質類；多態性，單核苷酸；哈薩克族；ADAM33基因；單體型

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種呼吸系統的常見疾病，其特點為氣流持續性受限，并且疾病的發展呈漸進性。目前COPD發病機制尚未完全清晰，可能受環境以及遺傳這兩方面因素影響。2002年

Van Eerdewegh等［1］通過定位克隆的方法確定了ADAM33基因是支氣管哮喘疾病的影響因素，且與氣道高反應性也存在相關性。隨后國內外學者對該基因和COPD之間的關系進行研究，發現ADAM33基因在COPD的發病過程中發揮作用，并顯示其單核苷酸多態性（SNP）與肺功能的快速下降也存在相關性［2］。本研究旨在探究哈薩克族人群ADAM33基因多態性與COPD易感性的相關性，進一步從分子水平研究新疆地區哈薩克族人群COPD病程進展中遺傳因素的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象選擇2013年5月—2015年5月石河子大學醫學院第一附屬醫院、伊犁州友誼醫院、伊犁州新華醫院及塔城沙灣縣人民醫院呼吸內科住院部、門診確診為COPD的哈薩克族患者197例作為病例組，符合2013年中華醫學會呼吸分會制定的COPD診療指南的診斷標準，并且在入組前未使用過茶堿類、β2受體激動劑和糖皮質激素類藥物進行對癥治療。對照組為同期在以上醫院門診或體檢中心挑選出的哈薩克族體檢健康者193例。排除肺部其他疾病以及胸部手術史。2組性別、年齡、吸煙指數比較差異無統計學意義，肺功能第1秒用力呼氣容積（FEV1）預計值（%）、FEV1/用力肺活量（FVC）差異有統計學意義（肺功能選在病例組病情處于穩定期時測定），見表1。本次試驗全部入選人員必須簽署知情同意書并且通過我院倫理委員會的同意后方可進行。

Tab.1Basic information of these two groups表1 2組基本資料比較

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取抽取全部研究對象的靜脈血（手背部）5 mL，EDTA抗凝，采用由北京TIANGEN生化科技公司提供的非離心柱型試劑盒提取血液基因組DNA，并儲存于-80℃冰箱以便備用，運用超微量分光光度計對DNA純度及濃度進行檢測。

1.2.2 Q-1、T2位點多態性的測試（1）設計引物。根據GenBank提供的基因序列，運用Primer3軟件對引物進行設計，F+1位點的引物序列為：F 5′-GAGGCCACTGGAACCTCCTGTT-3′，R 5′-GTGGTGCACCTGCTCAGGACTC-3′；S2位點：F 5′-GAGGCCACTGGAACCTCCTGTT-3′，R 5′-GTGGTGCA CCTGCTCAGGACTC-3′；ST+5位點：F 5′-TGCCCACAGA CCCTCAATCAC-3′，R 5′-GGGCCCAGCACATCTTTTCAC-3′；T1位點：F 5′-AGGGTCTGGGAGAAATGGTGGA-3′，R:5′-CACTGTGCCAACCTCCTGGACT-3′。4個位點擴增長度分別為278、365、369、311 bp。（2）對目的片段進行PCR擴增反應?？侾CR反應體系為10 μL，包含1× HotStarTaq buffer、Mg2+3.0 mmol/L、dNTP 0.3 mmol/L，HotStar-Taq polymerase（Qiagen Inc.）1 U、DNA樣本1μL和多重PCR引物1μL。循環PCR程序：循環11次以下過程，變性95℃2 min；變性94℃20 s，退火65℃40 s，每次循環降低0.5℃，延伸72℃1.5 min；變性94℃20 s，退火59℃30 s，延伸2℃1.5 min，循環24次；延伸72℃2 min，在4℃條件下保存。取擴增產物1.5 μL制膠后進行電泳檢測，若有目的片段則驗證擴增成功。（3）PCR產物純化。取10 μL PCR產物然后加5 U SAP酶和2 U核酸外切酶Ⅰ，在37℃恒溫水浴鍋中1 h，75℃15 min對酶進行滅活。（4）延伸反應。延伸過程共需10 μL，其中含有超純水2 μL、SNaPshot Multiplex Kit（ABI）5 μL、多重PCR純化后產物2 μL以及延伸引物混合物1 μL。延伸引物濃度：F+1為0.8 μmol/L、S2為0.8 μmol/L、ST+5為0.8 μmol/L、T1為0.5 μmol/L。延伸過程：變性96℃1 min；變性96℃10 s，退火55℃5 s，延伸60℃30 s，循環28次；4℃條件下保存。純化延伸產物：取延伸產物10 μL并放入SAP酶1 U，在37℃恒溫水浴鍋中1 h，75℃對酶進行滅活15 min。（5）在ABI3730XL測序儀上對延伸產物進行測序。經過純化的延伸產物0.5 μL、Liz120 SIZE STANDARD 0.5 μL、LHi-Di Formamide 9 μL，變性95℃5 min后進行測序。運用Gene-Mapper 4.1（Appliedbiosystems）軟件對本實驗結果進行分析。

1.3 統計學方法運用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計量資料用表示，符合正態分布的計量資料2組間比較用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析。計數資料組間比較用χ2檢驗，采用基因計數法計算基因頻率，Haploview軟件分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律；組間基因型和等位基因頻率分布的比較采用χ2檢驗，運用Phase軟件進行單體型推斷。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ADAM33基因F+1、S2、ST+5、T1位點測序結果F+1、ST+5、T1位點病例組及對照組共390個樣本基因分型成功；S2位點病例組191個樣本基因分型成功，6個樣本基因分型失敗，對照組190個樣本基因分型成功，3個樣本基因型分型失敗。測序結果運用GeneMapper 4.1軟件處理得出的各位點SNaPshot圖像，見圖1～4。

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡符合度檢驗F+1、S2、ST+5、T1位點基因型的分布符合與Hardy-Weinberg遺傳平衡（P分別為0.680、0.700、0.591、1.000），選取的樣本群體代表性良好。

2.32 組基因型以及等位基因頻率分布的比較見表2。在病例組與對照組F+1位點基因型及等位基

因頻率分布比較差異有統計學意義（P＜0.05），S2、ST+5、T1位點基因型以及等位基因頻率分布的比較差異無統計學意義。

2.4 病例組ADAM33基因F+1位點各基因型與肺功能的關系病例組F+1位點各基因型的FEV1預計值和FEV1/FVC的比較差異無統計學意義，見表3。

Fig.1F+1 locus waveform and genotypes in ADAM33 gene圖1 ADAM33基因F+1位點的波形和基因型

Fig.2S2 locus waveform and genotypes in ADAM33 gene圖2 ADAM33基因S2位點的波形和基因型

Fig.3ST+5 locus waveform and genotypes in ADAM33 gene圖3 ADAM33基因ST+5位點的波形和基因型

Fig.4T1 locus waveform and genotypes in ADAM33 gene圖4 ADAM33基因T1位點的波形和基因型

Tab.2Comparison the gene frequency and allele frequency of F+1，S2，T1 and ST+5 locus between two groups表2 2組F+1、S2、T1、ST+5位點基因型以及等位基因分布頻率的比較例（%）

Tab.3Relationship between ADAM33 genotypes and pulmonary function in case group表3 病例組ADAM33基因F+1位點基因型與肺功能指標的關系（%，）

Tab.3Relationship between ADAM33 genotypes and pulmonary function in case group表3 病例組ADAM33基因F+1位點基因型與肺功能指標的關系（%，）

均P＞0.05

基因型C C C T T T F n 9 5 7 3 2 9 F E V 1預計值6 0 . 7 8 ± 1 3 . 2 6 6 5 . 4 4 ± 1 6 . 6 0 6 0 . 2 4 ± 1 6 . 5 7 2 . 3 3 0 F E V 1 / F V C 6 2 . 9 5 ± 8 . 3 4 6 4 . 8 1 ± 7 . 7 3 6 5 . 1 0 ± 7 . 6 3 1 . 4 6 2

2.5 ADAM33基因位點單體型的分析F+1、S2位點有4種單體型，Hap1（CC）在對照組和病例組分布差異有統計學意義（P＜0.05），且OR＜1，此單體型可能降低發生COPD的風險；Hap3（TC）在對照組和病例組分布差異有統計學意義（P＜0.05），且OR＞1，此單體型可能增加了COPD發病的風險；Hap2（TG）、Hap4（CG）單體型在2組間分布差異無統計學意義，見表4。ST+5、T1位點3種單體型在2組間比較差異無統計學意義，見表5。

Tab.4Analysis of haplotype in F+1 and S2 locus in ADAM33 gene表4 ADAM33基因F+1、S2位點單體型的分析例（%）

Tab.5Analysis of haplotype in ST+5 and T1 locus表5 ADAM33基因ST+5、T1位點單體型的分析例（%）

3 討論

ADAM33基因是ADAM家族的一員，主要表達于肺組織的成纖維細胞、平滑肌細胞以及支氣管上皮細胞，與氣道炎癥、重塑及血管生成有關［2］，而氣道炎癥在氣道重塑、膠原量增加以及瘢痕形成中發揮重要作用，這些也是導致氣道狹窄的關鍵。氣道狹窄、氣道炎癥及氣流受限為COPD的病理基礎，所以國內外專家開始對ADAM33基因與不同種族、不同國家COPD人群易感性之間的關系進行研究，但ADAM33基因在COPD的發病機制中的作用尚未明確。

目前ADAM33基因已經成為研究COPD易感性的熱點基因。Shah等［3］通過對生活在克什米爾地區的COPD人群與ADAM33基因的關系進行了相關的研究，結果表明T1、T2位點GG基因型及Q-1位點AG基因型與COPD病程進展有關，T1、T2位點的G等位基因是當地人群患有此病的危險因素。Gosman等［4］對荷蘭人群ADAM33基因多態性進行探究，得出的結論為T2、T1、S2、ST+5位點的基因型與COPD的發生有關，但Q-1、S1、F+1、V4位點與COPD并無相關性。Sadeghnejad等［5］對880例年齡在50歲以上并且有20年以上吸煙史的美國白種人群ADAM33基因多態性進行研究，結果為S2位點與肺功能指標降低以及COPD的發病進程有關。近些年，我國學者也開始關注此方面并對我國各民族人群進行研究。Tan等［6］運用多聚酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCR-RELP）的方法對蒙古族人群ADAM33基因上8個位點的多態性進行檢測，結果顯示S2等位點與蒙古族COPD發病無明顯關系。Xiao等［7］對我國藏族COPD人群進行研究，結果顯示ADAM33基因T1位點的AG基因型與COPD易感性相關。根據以上研究顯示ADAM33基因F+1、S2、ST+5、T1位點與COPD之間關系尚存在爭議，因此F+1、S2、ST+5、T1位點與COPD易感性的關系仍有進一步探究的價值。

本課題組蔣濤等［8］對新疆哈薩克族COPD人群與ADAM33基因S1、V4位點之間的關系進行研究，發現V4及S1位點是COPD病程進展的影響因素。郝娥娥等［9］對新疆維吾爾族COPD人群與ADAM33基因S1、S2位點間的關系進行研究，但并未發現二者之間有關。本研究顯示，ADAM33基因F+1位點的基因型以及等位基因的頻率分布在新疆哈薩克族的病例組與對照組間比較差異有統計學意義，因此推測哈薩克族COPD易感性與F+1位點可能有關，但并未發現該位點和肺功能相關指標之間的關系；F+1、S2位點單體型分析顯示，單體型Hap1（CC）在病例組的頻率分布明顯低于對照組，表明此單體型有降低發生COPD風險的可能性，單體型Hap3（TC）在病例組的頻率分布明顯高于對照組，因此該單體型增加了患COPD的風險，S2、ST+5、T1位點與新疆哈薩克族COPD人群的發病過程無關聯。以上結果與其他國家及我國其他民族得出的結論存在差異，可能不同種族人群ADAM33基因各位點發揮的作用不同，也可能與生活環境有關，且ADAM33基因位點較多，各位點間存在連鎖不平衡，并不能確定哪個位點起到決定性作用，應建立與疾病有關的完整基因體系。今后還需要深入研究，以進一步闡明COPD的遺傳易感機制。

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（2015-07-27收稿 2015-09-01修回）

（本文編輯 李國琪）

Association between ADAM33 gene polymorphism with chronic obstructive pulmonary disease incidence in Kazakh of Xinjiang

WANG Shasha，GUAN Jian△，WANG Shan，CHENG Fangjuan，REN Xia，XU Xilin，GAO Yan
Department of Respiratory Medicine，The First Affiliated Hospital of Medical School，Shihezi University，Shihezi 832008，China△

ObjectiveTo explore correlation of Xinjiang Kazakh population who suffered from COPD with polymorphisms of F+1，S2，T1，ST+5 locus of ADAM33 gene.MethodsBlood samples（n=193）from healthy controls（Control group，n=193）and COPD patients（Case group，n=197）were detected by SNP SNaP shot.ResultsComparing case group with the control group，gene frequency and allele frequency of F+1 locus were of significant differences（P＜0.05）.In patient group，there were no significant differences in F+1 locus genotype and in clinical indicators include lung function FEV1 predicted and FEV1/FVC（P＞0.05）.The gene frequencies and allele frequency of S2、T1 and ST+5 locus were not significantly different between case group and control group（P＞0.05）.F+1 and S2 locus were analyzed by haplotype analysis which showed that there was significant differences in Hap1（CC）haplotype between case group and control group（P＜0.05），and OR＜1 indicated that its haplotype may reduce the risk of COPD.There were significant differences（P＜0.05）in Hap3（TC）haplotype between case group and control group and OR＞1 revealed that its haplotype may increase the risk of COPD.The distribution of Hap2（TG）and Hap4（CG）were not significantly different（P＞0.05）between the 2 groups.T1 and ST+5 locus were analyzed by haplotype analysis which showed significant differences in haplotypes between case group and control group（P＜0.05）.ConclusionThe occurrence of COPD may be related to the polymorphism of ADAM33 gene in F+1 locus in Xinjiang Kazakh.

pulmonary disease，chronic obstructive；ADAM proteins；polymorphism，single nucleotide；KAZAKH NATIONALITY；ADAM33 gene；haplotype

R563

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.12.002

國家自然科學基金資助項目（81360009）

石河子大學醫學院第一附屬醫院呼吸內科（郵編832008）

王莎莎（1990），女，碩士研究生，主要從事呼吸系統疾病研究

△通訊作者E-mail:guanjian6@163.com