阿姆斯特丹散囊菌鑒別與發酵

韓省華，夏湛恩，吳文娟，沈 雯

（杭州華丹農產品有限公司院士工作站，浙江杭州 310024）

阿姆斯特丹散囊菌鑒別與發酵

韓省華，夏湛恩，吳文娟，沈 雯

（杭州華丹農產品有限公司院士工作站，浙江杭州 310024）

阿姆斯特丹散囊菌是從杭州市陳置多年的黑茶“伏磚”中分離純化得到的，經中科院微生物所鑒定，屬阿姆斯特丹菌種，但經多年自然誘變及分離純化，其形態特征有別于國內現有菌種。通過發酵發現，在不同于黑茶的培養基上同樣產生黑色素，且其代謝產物對立枯病菌和紋枯病菌等有不同程度抑制作用。該菌的發酵產物具有新特點，該菌應屬于阿姆斯特丹散囊菌亞種。

阿姆斯特丹散囊菌亞種；引物；液體發酵；拮抗；黑色素

黑茶一詞始見于清代嘉慶三年（1542年），距今已有400多年歷史，到清代形成專銷西北的“官茶”，發展至今有“伏茶”“伏磚”“金花”等稱謂，不僅名稱各異，分離的菌種也不同，但總體均屬冠突散囊菌類（Eurotium cristatum），屬青綠曲霉。經中科院微生物所鑒定，屬該曲霉的阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami L.Mangin）類，經加入引物發酵，從菌絲體中能產生降低血脂的活性物質，對一些有害真菌有抗性。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

供試菌種從多種茶葉制品中分離篩選得到冠突散囊菌菌種，經進一步分離純化得到生長速度快、形態健壯的菌種，即為F1代的菌種。試劑有真菌基因組DNA提取相關的試劑盒；Ex Taq酶和PCR測序相關的試劑；菌種發酵相關的試劑，發酵原料如茶汁、淀粉、魚、畜粉等農副原料。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的分離篩選

茶葉微生物分離按國際食品微生物學檢驗方法（GB 4789—2010）進行操作分離。

1.2.2 微生物鑒定

由中國科學院微生物研究所，按照真菌分類標準進行分類鑒定［1-3］。顯微性狀結構按插片法、涂片及粘片法進行。

1.2.3 引物發酵方法

由于在黑茶、伏磚中的阿姆斯特丹散囊菌根據形態特性不同，應是杭州亞種，生長速度比較慢，通常需經1～2個月生長周期，有的甚至更長。研究發現，利用某些有機引物可破解及加快發酵進程，如利用玉米汁、土豆汁及黑茶汁可加快菌種發酵。同時通過發酵配方、發酵溫度、發酵酸堿度對菌絲體生長的研究，篩選發酵最佳狀況，縮短發酵周期。

2 結果與分析

2.1 受試菌種的鑒定

2.1.1 分子分類依據

真菌核糖體基因及間隔區有不同進化程度，有的序列較保守，有的序列變異較快，可根據序列進行真菌鑒定。位于18S rDNA的3＇端與28S rDNA的5＇端之間的序列稱為核糖體內轉錄間隔區（internal transcribed sPacers，ITS）。本研究使用的引物為真菌ITS上的一段保守序列，引物序列如下:

ITS4:5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇；

ITS5:5＇-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3＇。

2.1.2 DNA提取

研磨組織塊→移入盛有CTAB的小管→55～65℃孵育→加氯仿異戊醇抽提后離心→上清液加NaAc和異丙醇沉淀DNA、離心→棄上清、乙醇洗沉淀2次→干燥后TE溶解。

2.1.3 PCR擴增和測序

94℃預變性4 min，（94℃1 min→56℃40 s→72℃40 s）30個循環。序列流水號196-ITS4 -A47966-G09-1309020291G和196-ITS5-A47966-E09-1309020291G。

2.1.4 DNA序列比較分析和系統樹構建

用校正后的供試樣品的內轉錄間隔區區域序列，在GenBank核酸序列數據庫中進行同源序列比較搜索（BLASTn）。根據同源序列搜索的結果，下載與之相關的真菌的內轉錄間隔區區域序列，與供試樣品的序列一起用Mega軟件進行匹配分析，然后用Phylogenetic Tree顯示系統樹，同時顯示序列間的相似度。

所顯示的系統樹見圖1。

圖1 基于內轉錄間隔區區域序列分析所繪制的系統樹

根據分子分類依據，青綠曲霉屬于冠突散囊菌中的阿姆斯特丹散囊菌，但該菌種某些特性已發生變異。

如在形態上，菌絲體及發酵產生的菌絲體的孢子柄較長，且子囊果呈橢圓形（圖2中1）。菌種液體發酵時，不僅在茶葉中產生黑色素，在其他培養基中亦產生黑色素（圖2中2）。其代謝產物對有害真菌如對紋枯病菌、立枯病菌等能產生一定的拮抗作用（圖2中3），至今尚未見研究報道。據此可知該菌種應為阿姆斯特丹菌種的亞種。

圖2 阿姆斯特散囊菌不同發酵時間的搖瓶形態

2.2 阿姆斯特丹散囊菌的發酵

采用阿姆斯特丹散囊菌液體發酵［4-5］，因液體發酵較固體生長發酵周期要縮短數倍，加入原料的安全性可控，發酵環境和條件如溫度、PH值、通氣量可人工控制，所形成的產品質量好，且生產成本更低，利于產業化。

2.2.1 阿姆斯特丹散囊菌杭州亞種的發酵

阿姆斯特丹散囊菌杭州亞種發酵采用加入引物發酵的方法，發酵周期為78～96 h。冠突散囊菌的整個發酵過程如圖3所示。

圖3 阿姆斯特丹散囊菌發酵過程

圖3 顯示，從起始至8～10 h，孢子開始萌發，至30～45 h菌絲生長形成小網狀，30 h后開始產生孢子，伴隨菌絲體的伸長，新孢子萌發形成新菌絲，菌絲體似犬牙交叉，菌絲體量開始大量增加，72 h后菌絲體達最大值，其量接近冬蟲夏草菌種的量。發酵至72 h前后，有些菌絲形成空泡，其中內容物開始析出，發酵產物開始發黑，其碳氮利用率下降接近發酵終點。

2.2.2 不同配方對發酵的影響

根據冠突散囊菌的生長特點以及碳氮利用的特點，分別設計不同C:N的發酵配方，同時利用玉米汁、土豆汁及黑茶汁等多種有機浸出物為引物，利用價廉的農資原料，如玉米粉、黃豆餅粉、山芋淀粉、玉米淀粉及蛋白胨、魚粉、麩皮，并加少量KH2PO4等礦物原料，設計多種發酵配方。不同配方對菌絲體鮮重的影響見圖4。

圖4 顯示，4和5號發酵配方較適合阿姆斯特丹杭州亞種發酵。當發酵至50～72 h時，菌絲體進入對數生長期，菌絲體量逐步達最大值，然后菌絲體出現空泡及自溶，菌絲體量開始逐步下降。

2.2.3 酸堿度對發酵的影響

研究發現，酸堿度對阿姆斯特丹杭州亞種的發酵影響較大（圖5）。

圖5顯示，在PH＜3.5時，菌絲生長受到抑制，發酵速度變慢，甚至不能發酵；而當PH＞9.5時，菌絲體的生長同樣受到影響，發酵速度變慢，甚至不能正常發酵。試驗證明，當PH在6.5左右是發酵最適酸堿度，菌絲生長很舒展，發酵速度加快，發酵菌對原料的利用正常，所形成的產品質量好。

圖5 不同PH值對菌絲體鮮重的影響

2.2.4 溫度對發酵的影響

溫度對阿姆斯特丹杭州亞種的發酵亦有影響。圖6顯示，在溫度低于24.5℃時，發酵速度明顯變慢，發酵周期延長，但菌絲可繼續生長；在25.5℃～26.5℃時，菌絲生長速度較快，發酵情況正常，糖代謝情況正常；當溫度升至29.5℃以上，菌種發酵減慢，菌絲生長出現異常，若溫度持續增高，甚至出現菌絲體自溶現象。

圖6 不同溫度對菌絲體鮮重的影響

3 小結

試驗通過菌種的分離鑒定和發酵，建立一套新的發酵技術，并通過研究優化發酵條件，為進一步研究創造條件。試驗還將進一步探索發酵過程中糖代謝和酸堿度變化規律，以及菌種菌絲體的形態變化規律等，能夠更進一步提高菌絲體產量及品質。

［1］ 溫瓊英.伏磚茶中優勢菌群的種名鑒定［J］.中國茶葉，1990（6）:2-3.

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［3］ 齊祖同，孫曾美.伏磚茶中優勢菌群的鑒定［J］.真菌學報，1990，9（3）:176-179.

［4］ 周傳云.食品微生物實驗技術［M］.長沙:湖南農業大學，1999.

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（責任編輯：張瑞麟）

TS 272

A

0528-9017（2015）03-0380-03

10.16178/j.issn.0528-9017.20150331

2014-10-20

韓省華（1956-），陜西城固人，高級農藝師，從事真菌應用研究工作。E-mail:403564228@qq.com。

文獻著錄格式:韓省華，夏湛恩，吳文娟，等.阿姆斯特丹散囊菌鑒別與發酵［J］.浙江農業科學，2015，56（3）:380-383.