RhoA相關(guān)信號(hào)通路的表達(dá)對(duì)COPD大鼠氣道重塑的影響

徐新毅 劉友琴 徐丹 楊義

﹙1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550003；2.貴州省人民政府機(jī)關(guān)門(mén)診部，貴州 貴陽(yáng) 550004；3.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)550002﹚

慢性阻塞性肺疾病（COPD）現(xiàn)已成為威脅全球公共健康的最常見(jiàn)的慢性疾病之一，COPD 患者肺部的主要病理變化是呼吸道持續(xù)性炎癥和不可逆的氣流阻塞［1］。氣道重塑則是導(dǎo)致氣流阻塞的重要原因，而氣道重塑主要表現(xiàn)為平滑肌細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白過(guò)度沉積。有研究［2－3］表明，在重癥COPD 患者中還觀察到氣道平滑肌（ASM）組織增生。Rho／ROCK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)了多種平滑肌與非平滑肌功能異常相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制。而Rho家族蛋白有Rho（RhoA，RhoB 和RhoC）。Rho／ROCK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與支氣管哮喘氣道重塑，我們選取RhoA 基因?yàn)橹饕芯繉?duì)象，通過(guò)RhoA 基因在COPD 大鼠肺組織的表達(dá)及地塞米松治療的干預(yù)，探討RhoA 基因及其相關(guān)通路對(duì)COPD 大鼠氣道重塑的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物分組及處理 60只SPF級(jí)雄性SD 大鼠（重慶滕鑫生物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK（渝）2012－0006），鼠齡8～9周，體質(zhì)量（200±10）g，分為正常對(duì)照組、COPD 模型組、地塞米松治療組各20只。

1.2 儀器及試藥 一抗兔抗大鼠（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供）；二抗山羊抗兔（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供）；ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀。

1.3 COPD 大鼠模型制備及給藥COPD 模型組大鼠及地塞米松組大鼠選用市面出售的黃果樹(shù)牌過(guò)濾嘴香煙，按文獻(xiàn)［4］完成COPD 模型的制作，將大鼠分別置于自制的60cm×45cm×55cm 有機(jī)玻璃箱內(nèi)，箱頂部有4個(gè)2cm 的通氣孔，每個(gè)煙熏箱內(nèi)1次放置10只大鼠，于每天上午下午各煙熏1次，2次時(shí)間間隔至少6h，每次放置6只香煙，燃盡后更換香煙，持續(xù)30min，連續(xù)28d，COPD組及地塞米松治療組分別于第1天和第14天在氣管內(nèi)注射脂多糖，每次200μg／200μL，注射脂多糖當(dāng)天不熏煙，正常對(duì)照組注入相同體積的0.9%氯化鈉溶液，地塞米松治療組從造模30d開(kāi)始給予地塞米松注射劑1mg／（kg·d），腹腔注射，療程30d，30d后處死大鼠。

1.4 支氣管肺組織RhoA 蛋白含量的測(cè)定 60例標(biāo)本均經(jīng)4%多聚甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋，切片，選用鏈霉親和素過(guò)氧化酶（SP）法進(jìn)行，微波加熱法修復(fù)抗體，DAB顯色，每組切片任選1張用PBS液代替一抗作陰性對(duì)照，采用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)RhoA 蛋白的表達(dá)，RhoA 抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）濃度為1∶100。

1.5 免疫組化結(jié)果判定 RhoA 的陽(yáng)性表達(dá)為位于細(xì)胞胞漿的棕黃色顆粒。按染色強(qiáng)弱及陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分：（1）染色強(qiáng)度評(píng)分：不顯色或顯色不清0分；淺黃色1分；棕黃色2分；深褐色3分。（2）陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分：每例標(biāo)本各取4張切片，于光鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，至少計(jì)數(shù)500個(gè)以上的細(xì)胞，算出陽(yáng)性細(xì)胞比例。陽(yáng)性細(xì)胞比例＜1%為0分；2%～10%為1分；11%～50%為2分；51%～80%為3分；81%～100%為4分。兩種評(píng)分得分結(jié)果相乘：＜2分為陰性（－）；2～3分為弱陽(yáng)性（＋）；4～5分為中度陽(yáng)性（＋＋）；≥6分為強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋）。

1.6 Real－time PCR 檢測(cè)RhoA 基因mRNA 的表達(dá) 采用Trizol試劑提取組織總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行RT－qPCR 的檢測(cè)，引物序列如下：GAPDH上游：5′－CAACGGGAAACCCATCACCA－3′下游：5′–ACGCCAGTAGACTCCACTCCACGACAT－3′（43bp）；RhoA：上游：5′－GTCCAAATGTGCCCATCATCCTA－3′上游：5′－CTGAACACTCCATGTACCCAAAGC－3′（22bp）；Real－time PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10min，95 ℃變性15s，60 ℃退火15s，72 ℃延伸35s，共40 個(gè)循環(huán)，用GAPDH 為內(nèi)參，采用2－△△CT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 正常對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，行為和飲食均未見(jiàn)異常，行動(dòng)敏捷，呼吸平穩(wěn)，皮毛有光澤；COPD 模型組大鼠表現(xiàn)煩躁或精神不振，進(jìn)食和進(jìn)水量均有所減少；時(shí)有咳嗽，毛色枯槁；地塞米松治療組大鼠上述表現(xiàn)減輕。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前各組大鼠均無(wú)死亡。

2.2 Real－time PCR 檢測(cè)RhoA 基因mRNA 水平的相對(duì)表達(dá)量 RhoA 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，具有可重復(fù)性，證明RNA 具有較好的擴(kuò)增能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用2－△△CT法進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表1。與正常對(duì)照組比較，COPD 模型組大鼠RhoA mRNA 表達(dá)增高（P＜0.05），地塞米松組RhoA mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05）；與正常對(duì)照組比較，COPD 模型組和地塞米松治療組RhoA mRNA 表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。免疫組化結(jié)果見(jiàn)表2及圖1～3。與正常對(duì)照組比較，RhoA 在正常對(duì)照組、COPD 模型組和地塞米松治療組蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為20%（4／16），45%（9／20），35%（6／20）；與正常對(duì)照組比較，COPD 模型組蛋白陽(yáng)性表達(dá)率增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與COPD 模型組比較，地塞米松治療組蛋白陽(yáng)性表達(dá)率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠RhoA mRNA 的表達(dá)（±s）

表1 各組大鼠RhoA mRNA 的表達(dá)（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，＊P＜0.05；與COPD 模型組比較，＊＊P＜0.05。

表2 各組大鼠肺組織RhoA 免疫組化結(jié)果（n=20）

圖1 正常對(duì)照組（RhoA組化染色×200）

圖2 COPD 模型組（RhoA組化染色×200）

圖3 地塞米松治療組（RhoA組化染色×200）

3 討論

COPD的早期主要病理變化是氣道炎癥，氣道重塑則是COPD 氣流阻塞的病理基礎(chǔ)。而氣道平滑肌細(xì)胞則是氣道重塑過(guò)程中最重要的效應(yīng)細(xì)胞之一，其中RhoA 基因?qū)獾乐厮芷鹬匾饔谩hoA激酶通過(guò)激活ROCK 作用于氣道的平滑肌細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和炎性因子等的產(chǎn)生，影響氣道重塑的發(fā)生和發(fā)展。RhoA 蛋白是細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之一，具有GTP組酶活性。文獻(xiàn)［5］報(bào)組道，RhoA組主要通過(guò)調(diào)控MFs的重組參與細(xì)胞增殖、遷移和凋亡等過(guò)程；它還可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架的聚合狀態(tài)，參與細(xì)胞形態(tài)、極性、細(xì)胞黏附、轉(zhuǎn)移、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞吸附等。本文結(jié)果顯示，COPD 模型組RhoA 基因mRNA 的表達(dá)高于正常組（P＜0.05），證實(shí)RhoA 基因參與COPD 氣道重塑這一過(guò)程。通過(guò)前期相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究我們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－1（TGF－β1）的蛋白及mRNA 在慢性肺阻塞疾病大鼠模型的支氣管黏膜、肺組織均處于高表達(dá)，提示此因子可能參與了COPD 的發(fā)病過(guò)程。而Rho／ROCK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能被多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)激活，其中包括TGF－β1、血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）、內(nèi)皮素－1（ET－1）等［6］。本文免疫組化結(jié)果表明，地塞米松治療組蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于COPD 模型組（改變趨勢(shì)P＜0.05）。地塞米松治療組RhoA mRNA 的表達(dá)與RhoA 免疫組化結(jié)果的改變具有一致性，說(shuō)明地塞米松能夠抑制RhoA mRNA 及蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制平滑肌細(xì)胞的增生，從而有效地改善氣道重塑。

［1］中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組.慢性阻塞性肺疾病診治指南：2013年修訂版［S］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2013，36（4）：255－264.

［2］Hogg JC，Chu F，Utokaparch S，et al.The nature of small－airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease［J］.The New England journal of medicine，2004，350（26）：2645－2653.

［3］Mcdonough JE，Yuan R，Suzuki M，et al.Small－airway obstruction and emphysema in chronic obstructive pulmonary disease［J］.The New England journal of medicine，2011，365（17）：1567－1575.

［4］宋一平，崔得健，茅培英.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型建立及藥物干預(yù)的影響［J］.中華內(nèi)科雜志，2000，39（8）：556－557.

［5］David M，Petit D，Bertoglio J.Cell cycle regulation of Rho signaling pathways［J］.Cell Cycle，2012，11：3003－3010.

［6］Vardouli L，Vasilaki E，Papadimitriou E，et al.A novel mechanism of TGF beta－induced actin reorganization mediated by Smad proteins and Rho GTP ases［J］.FEBSJ，2008，275：4074－4087.