氯沙坦對靜態牽張刺激導致肥大心室肌細胞中L型鈣離子通道表達的影響

楊君 楊龍 鄭亞西 牛晨光 田龍海 夏桂玲 田水 張羽坤 唐倩

（1.貴陽醫學院，貴州 貴陽 550004；2.貴州省人民醫院心內科，貴州 貴陽 550002；3.河南大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000；4.貴州航天醫院心內科，貴州 遵義 563003；5.貴州醫科大學附屬醫院，貴州 貴陽 550004）

心力衰竭（心衰）發病率及死亡率目前仍居高不下，是心源性死亡的主要病因之一，心衰時，受損心肌通過改變心肌收縮力、導致心肌肥大及電生理的重構起到代償作用［1－2］。心肌肥大是心臟長期承受過重負荷，靠質量增加、收縮力加強產生的一種緩慢而有效的代償方式［3］。這種代償在維持充足心搏量的同時會增加耗氧量，導致組織結構重構、細胞膜電位改變等，從而導致和促進心力衰竭，誘導心律失常［4］。肥大心肌細胞會引起大量第二信使相關通路的激活，其中血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）信號的激活與心肌肥大之間存在密切相互作用［5］。腎素－血管緊張素－醛固酮系統（RAS）激活增強血管收縮、促進機體水鈉潴留，使回心血量和有效血容量增加；心臟前、后負荷的顯著增加進一步惡化心力衰竭。因此，血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）或AT1R 拮抗劑（ARB）能在有效降低血壓的同時起到保護心肌肥大的作用［6］。研究［7］表明，AT1R 拮 抗劑氯沙坦不僅可降低收縮壓，并且阻止心肌肥大。因而本研究擬通過靜態牽張刺激體外培養的心室肌細胞，用血管緊張素受體阻斷劑氯沙坦干預，探討氯沙坦在靜態牽張刺激導致的心室肌細胞L－型鈣離子通道改變中的作用［8］。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 胎牛血清（FBS）和DMEM 高糖培養基由Gbico 公司生產，胰酶和Ⅱ型膠原酶購自Sigma公司，免疫組化試劑盒購自碧云天公司，蛋白－DNA－mRNA 共提取試劑盒購自Omega生物技術公組司，Cav1.2組抗組體組購組自Abcam組公組司，SYBR Premix Ex Taq購自Takara公司，α－橫紋肌動蛋白（α－SCA）單克隆抗體購自博士德生物工程有限公司，其他試劑均為國產分析純以上級別。

1.2 心室肌細胞培養與鑒定 出生1d的清潔級SD 大鼠用乙醚氣霧麻醉。取近心尖中下2／3的心室組織，洗去血液，剪至約1mm×1mm 的組織塊。用含0.05%胰酶和80mol／LⅡ型膠原酶的消化液消化，結合差速貼壁法獲得心室肌細胞，置于37℃、5%CO2培養箱中，用含10%FBS的DMEM 培養基培養。通過細胞形態和α－SCA 陽性染色情況鑒定心室肌細胞。

1.3 實驗分組與處理 細胞于靜態牽張裝置硅膠模上貼壁培養24h，更換含5%FBS的DMEM 培養基，分為4組。（1）對照組：不予干預；（2）牽張組：較基礎培養狀態增加20%硅膠模面積；（3）氯沙坦組：在培養液中加入氯沙坦10μmol／L；（4）靜態牽張＋氯沙坦組：在培養液中加入氯沙坦10μmol／L 干預2h后，增加20%硅膠膜面積。各組細胞分組培養后進行檢測。

1.4 牽張有效性鑒定 按試劑盒說明檢測細胞培養上清中BNP 水平；測定細胞DNA 和蛋白含量，計算蛋白／DNA 比值。結晶紫染色細胞并用軟件統計細胞面積大小。

1.5 基因mRNA 水平的檢測 采用Oligo 6.0軟件設計引物（序列見表1）。Trizol法提取細胞總mRNA，按SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明檢測基因mRNA 相對表達量。

表1 Cav1.2和GAPDH RT－PCR引物序列

1.6 蛋白質印跡法 提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度。取50μg總蛋白上樣，電泳后轉移蛋白至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉1h，加入相應一抗4 ℃孵育過夜。充分漂洗后加入辣根過氧化酶標記的二抗室溫孵育1h。充分漂洗后顯影、攝片并進行條帶灰度定量測定。

1.7 統計學處理 實驗數據采用Epidata 3.1軟件建立數據庫，使用SPSS 19.0進行數據分析。計數資料以（±s）表示。組間總體差異性比較用方差分析，多處理組與對照組比較用t檢驗，未計劃兩組間比較用q檢驗。檢驗水準α=0.05，如無特殊說明，P值表示雙側概率，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心室肌細胞培養與鑒定 倒置顯微鏡下可見心室肌細胞呈長梭形。心室肌細胞免疫組化染色呈陽性反應，胞漿內清晰可見棕褐色顆粒物，成纖維細胞呈現陰性，可見大量細胞核。見圖1。

圖1 心室肌細胞、成纖維細胞α－SCA 抗體免疫組化染色（×200）

2.2 牽張有效性 心室肌細胞受靜態牽張后結果顯示刺激24h的細胞蛋白／DNA 比值明顯增加（P＜0.001，n=3），而Losar干預可有效抑制此效應（P＜0.001，n=3，圖2）。靜態牽張心肌細胞使得其ANP基因表達（P＜0.01，n=3，圖3）均明顯增加。

圖2 4組心室肌細胞蛋白／DNA 比值（＊P＜0.001）

圖3 對照組與牽張組ANP基因表達比（＊P＜0.01）

2.3 L－型鈣離子通道基因表達情況 RT－PCR 技術加熒光定量法檢測樣本中初始目標mRNA 含量，結果顯示靜態牽張刺激顯著下調心室肌細胞Cav 1.2的mRNA 表達（P＜0.01，n=3）；Losar可有效抑制該效應（P＜0.05，n=3，圖4）。

圖4 牽張刺激心室肌細胞降低Cav1.2的

2.4 L－型鈣離子通道蛋白表達情況 WB 技術檢測蛋白表達，結果顯示靜態牽張刺激顯著下調心室肌細胞Cav1.2的蛋白表達（P＜0.01，n=3）；Losar可有效抑制該效應（P＜0.05，n=3，圖5，6）。

圖5 Cav1.2蛋白表達半定量分析結果（＊P＜0.05；＊＊P＜0.01）

圖6 免疫印跡檢測Cav1.2蛋白表達

3 討論

3.1 靜態牽張刺激致肥大心室肌細胞模型評價本實驗采用體外培養原代心室肌細胞，結合靜態牽張模仿過負荷導致的心室肌肥大，有效避免體內神經－體液因素的影響。若排除了機體復雜因素的干擾，即可較為單一的研究目標通路。試驗中牽張組心室肌細胞蛋白／DNA 比值、ANP基因表達和細胞面積明顯高于對照組，證明靜態牽張刺激導致心室肌細胞肥大模型建立成功，可用于后續實驗。

3.2 肥大心室肌細胞L－型鈣離子通道Cav1.2mRNA 和蛋白表達情況及AT1R信號調控作用 心力衰竭時部分離子通道表達發生改變，證明心衰是心律失常發生的重要獨立因素。有研究［9－10］指出心衰時心房細胞ICa－L降低，基因表達水平降低，但較少涉及蛋白水平及AT1R 信號調控。本研究發現與正常組比較，靜態牽張組心室肌細胞Cav1.2基因及蛋白表達均明顯受到抑制，這種現象能被AT1R阻滯劑Losar所抑制。證明牽張刺激可能通過激活AT1R信號通路導致心室肌細胞肥大，同時還通過該通路下調Cav1.2的表達。Losar可抑制牽張刺激所致的心室肌細胞肥大，這也提示了RAS參與心室肌細胞的重構過程。心衰導致RAS系統激活，可使心律加快進而鈣離子內流增加，超載的鈣離子可以反饋抑制L－型鈣離子通道［11］。進一步影響細胞內外鈣、鉀分布，心肌細胞電位不穩定，誘發心律失常。

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