miR-25對食管癌細胞系KYSE-150、EC109侵襲轉移能力影響差別的比較及意義探討

宋亞芹付文博盧沐劉洋魏育濤

（1.石河子大學醫學院，新疆石河子 832000；2.烏魯木齊自治區人民醫院心內科，新疆烏魯木齊 830000；3.石河子大學醫學院第一附屬醫院心胸外科，新疆石河子 832000）

miR-25對食管癌細胞系KYSE-150、EC109侵襲轉移能力影響差別的比較及意義探討

宋亞芹1付文博2盧沐1劉洋1魏育濤3*

（1.石河子大學醫學院，新疆石河子 832000；2.烏魯木齊自治區人民醫院心內科，新疆烏魯木齊 830000；3.石河子大學醫學院第一附屬醫院心胸外科，新疆石河子 832000）

目的：研究miR-25不同表達水平對食管癌細胞系KYSE-150、EC109侵襲轉移能力的不同影響并且探討這種差別對臨床工作的指導意義。方法：將miR-25模擬物、抑制劑、以及陰性對照轉染入食管癌細胞系KYSE-150及EC109，使miR-25在兩個細胞系中過表達及表達抑制；qRT-PCR法檢測轉染后不同組miR-25的表達情況；然后進一步通過Transwell細胞遷移實驗、細胞侵襲實驗研究miR-25對兩個細胞系侵襲轉移能力的影響。結果：miR-25過表達促進食管癌細胞系KYSE-150及EC109的侵襲轉移，抑制miR-25表達后KYSE-150的侵襲轉移能力明顯被抑制，而EC109的侵襲轉移能力變化不明顯。結論：miR-25促進食管鱗癌細胞的侵襲轉移，抑制miR-25對不同食管鱗癌細胞侵襲轉移能力影響不同。

食管癌/食管惡性腫瘤 microRNA25/miR-25 侵襲 轉移

一直以來食管癌是威脅世界人民生命健康的一大因素，其在世界范圍內的發病率和死亡率分別位于第八位和第六位。而我國處于食管癌高發區，發病率和死亡率居高不下，在國內所有食管癌病理類型中90%屬于食管鱗狀細胞癌［1］，這與早期食管癌難以識別以致延誤治療有很大關系。所以發現識別早期食管癌的分子機制及標記物是我們面臨的巨大挑戰，并且對于臨床靶向、個體化治療以及患者預后有著重要意義。

MicroRNAs （miRs）是近年來發現的一類長度約22個核苷酸序列的非編碼小分子RNA，它通過促使靶mRNA降解或抑制其翻譯來調節靶基因的表達，在細胞的分化增殖和凋亡，個體發育，機體代謝及免疫調節中都具有重要的作用［2］，研究發現人類腫瘤細胞和腫瘤組織內miRNA的表達水平和類型都與正常細胞和正常組織的miRNA表達水平明顯不同，并且已發現的人類miRNA大部分位于已知的腫瘤相關基因組區域內或已知的基因脆性位點［3］，這些都提示miRNA可能與腫瘤的發生有著密切的聯系，因此研究與腫瘤相關的miRNA分子機制將有助于理解腫瘤的發生發展過程，并有可能成為診斷腫瘤的潛在生物分子標記用來協助臨床實踐。

現已發現多種miRNA與腫瘤存在密切的聯系，Calin發現miR-15和miR-16基因在約68%的慢性淋巴細胞白血病病例中發生缺失或下調［3］，miR-197、miR-346在濾泡性甲狀腺癌，miR-221、miR-222、miR-181b在乳突狀甲狀腺癌中均呈高表達。MiR-25是miR-106b-25多順反子的一部分，位于染色體7q22.1上MCM7基因的第13個內含子區，Petrocca等研究發現miR-106b-25簇（miR-106b、miR-25、miR-93）在胃癌細胞中高表達［3］，Kan等發現，miR-106b-25多順反子在體外具有潛在的促進增殖拮抗凋亡促進細胞周期的作用，在體內有致瘤性，在腫瘤形成過程中逐漸上調，并與MCM7基因擴增和過表達相關，miR-25通過靶向和抑制Bim，參與食管腫瘤的形成和增殖［4］。然而目前為止對于miR-25與食管癌侵襲與轉移的研究還很少。也鮮有文獻報道miR-25的表達水平對不同食管癌細胞系侵襲轉移能力的影響差別，由于相同腫瘤不同細胞系間的細胞生物學特性也不盡相同，如增殖、遷移、成瘤，以及基因變化等方面可能存在差異，所以相同的實驗處理可能會帶來不同的實驗效果。本研究一方面探討miR-25表達水平對食管癌細胞系KYSE-150及EC109侵襲轉移能力的影響，一方面比較這種影響在兩種細胞系間的差別，為后續的實驗提供研究基礎。

1 材料和方法

1.1 細胞系

人食管鱗癌細胞系KYSE150及EC109購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所。

1.2 試劑

細胞中RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、定量試劑盒、Mir-25-3p定量檢測引物、U6內參定量檢測引物、MicroRNA的模擬物及抑制劑、轉染試劑、轉染實驗的陰性對照及陽性對照、靶基因β-actin內參引物均購自新疆貝思汀生物科技有限公司。

1.3 細胞培養

所有細胞均為RPMI-1640培養基（Gibco， USA）加10%胎牛血清（Invitrogen，Carlsbad，USA），于37℃含5%CO2的培養箱中培養。

1.4 細胞轉染

將兩個細胞系KYSE-150和EC109分別分為三組（mimic組、inhibitor組及control組）接種于六孔板中，采用新疆貝思汀生物科技有限公司的Hiperfect transfection reagent進行細胞轉染，操作按照說明書進行。

1.5 總RNA的提取、逆轉錄及實時熒光定量PCR（全過程注意無酶環境）

按照試劑盒miRNeasy Mini Kit （Qiagen， Germany）說明書操作步驟提取細胞總RNA，紫外分光光度儀測定總RNA濃度與純度，使A260/A280值在1.8-2.0。根據試劑盒miScript Ⅱ Reverse Transcription Kit （Qiagen， Germany）說明書操作步驟進行逆轉錄，根據試劑盒miScript SYBR Green PCR Kit （Qiagen，Germany）說明書操作步驟采用實時熒光定量-PCR（RT-qPCR）檢測miR-25水平，每組實驗至少重復3次。選擇miR-U6為內參，應用2-ΔΔCt方法計算目的基因相對表達水平。

1.6 Transwell細胞遷移實驗及細胞侵襲實驗 1）細胞遷移實驗

實驗前一天將細胞在無血清培養基中饑餓培養，然后分組進行轉染，將分組轉染后2 4 h的細胞消化并調整細胞濃度后接種到Transwell小室上室中，下室以胎牛血清作為趨化因子，接種后將24孔板置于37℃，5%CO2的培養箱中孵育，24h后取出小室，細胞固定、染色、計數，下室中細胞鏡下觀察分視野計數。2）細胞侵襲實驗 同細胞遷移實驗流程相似，不同的是Transwell小室內加入Matrigel膠（Coring Matrigel Basement Membrane Matrix）。

2 數據分析

采用SPSS20.0對數據進行統計學分析，所有數據以均數±標準差的形式表示，兩組間的差異比較采用t檢驗，檢驗結果p＜0.05為具有統計學意義。

3 結果

3.1 轉染后miR-25在兩個細胞系中的表達情況

為了研究miR-25的表達水平對食管癌細胞系生物特性的影響，人為轉染mir-25模擬物、抑制劑以及陰性對照試劑，造成KYSE-150細胞中miR-25的不同表達，采用qRT-PCR檢測兩個細胞系中三組細胞的miR-25表達情況，結果見圖1A.1B.。KYSE-150細胞系中mimic組與陰性對照組表達有差異，mimic組miR-25的表達明顯高于陰性對照組（p=0.001），而inhibitor組miR-25的表達明顯低于陰性對照組（p=0.007）；EC109細胞系中mimic組與陰性對照間表達也有差異，mimic組miR-25的表達明顯高于陰性對照組（p=0.027），inhibitor組miR-25的表達明顯低于陰性對照組（p=0. 007）。

3.2 miR-25對食管癌細胞系KYSE-150及EC109的侵襲轉移能力的影響有差別

Transell細胞遷移、侵襲實驗顯示，KYSE-150細胞系經轉染后mimic組穿膜細胞的數量明顯多于陰性對照組，inhibitor組則是相對陰性對照組明顯減少，差異均具有統計學意義（p＜0.05）；EC109細胞系經轉染后mimic組穿膜細胞的數量明顯多于陰性對照組（p＜0.05），而inhibitor組細胞相對陰性對照組無明顯減少，兩者差異無統計學意義（遷移實驗p=0.690；侵襲實驗p=0.809）見圖2.A，2.B及圖3.A，3.B。

4 討論

食管鱗狀細胞癌是起源于食管上皮組織的惡性腫瘤，其在全球的發病率和死亡率存在地域差別，而且男性患食管癌的風險高于女性［5］，這一致死性的疾病嚴重影響著人們的生命與生活質量。我國是食管鱗癌的高發國家，雖然隨著醫療科技的不斷發展，其死亡率有所下降，但在我國食管鱗癌的診斷與治療仍然形勢嚴峻，患者在接受傳統治療（外科手術、放射治療、化學抗癌藥物治療）后癌癥病情仍會惡化。這與早期食管鱗癌難以識別以致延誤治療有很大關系，另外，癌細胞的侵襲轉移能力也是影響患者預后的重要因素。侵襲與轉移是多步驟的生物學過程，包括：細胞粘附、遷移、血管發生、免疫逃逸和靶器官定植。所以發現辨識早期食管癌的分子標志并在此基礎上研究出更加精準的治療方法是醫學科研工作者的當務之急。

有研究表明miR-106b-25多順反子具有致癌性，其在腫瘤形成的過程中表達升高［6］，另有研究發現miR-25， miR-106b， miR-21，miR-203和miR-145在食管鱗狀細胞癌中的表達明顯不同于正常組織［7］，KimBH等人證實了miR-25與胃癌的淋巴結轉移相關［3］。既然miR-25在食管鱗狀細胞癌中也是高表達，那么我們推測其在食管鱗狀細胞癌的形成發展過程中也起到至關重要的作用，本研究就miR-25在不同食管鱗癌細胞系KYSE-150和EC109中的不同表達水平對食管鱗癌細胞侵襲轉移的影響做了進一步的探討。我們通過轉染miRNA模擬物、抑制劑及陰性對照成功使miR-25在兩個細胞系的三組細胞中表達有差異，然后對不同組細胞檢測食管癌細胞侵襲轉移能力，結果顯示miR-25的過表達及抑制對食管鱗癌細胞系KYSE-150的侵襲轉移都具有明顯影響，過表達后可明顯促進細胞的侵襲轉移能力，抑制后則顯著降低細胞的侵襲轉移能力；然而EC109的結果卻與此有所不同，過表達miR-25后同樣可以促進細胞的侵襲轉移，抑制miR-25后EC109細胞系沒有表現出明顯變化，其侵襲轉移能力沒有受到明顯影響，說明miR-25確實可以促進食管癌細胞的侵襲轉移能力，但就不同分化程度的癌細胞而言其作用效果不同。這對于以后的體外細胞實驗具有一定的指導意義。

體外培養的細胞是一種在特定條件下生長的細胞群體，它們保持著與體內細胞相同的基本結構和功能，具有相應理化和生物因素刺激的應答反應，對研究人類相關的組織器官的生物學性狀及相關疾病的發生機制有重要意義。本研究中使用的KYSE-150屬于低分化食管鱗狀細胞癌，而EC109屬于高分化食管鱗狀細胞癌，實驗結果提示我們miR-25對低分化食管癌細胞的侵襲轉移力的影響有可能高于高分化食管癌細胞。眾所周知，分化程度越低的癌細胞越可能具有較強的侵襲轉移能力，如果miR-25是影響其侵襲轉移的關鍵分子，就為我們將來針對每一位患者的精準醫療提供了有意義的治療靶向。雖然說miR-25在食管鱗狀細胞癌中起到致癌基因的作用，且實驗證實其能促進食管鱗癌的侵襲轉移，但是抑制其表達后對高分化食管鱗癌的侵襲轉移影響不大，這就提醒我們，miR-25在診斷食管癌、判斷病情的進展程度和患者預后中具有一定的意義，但如果涉及未來的靶向治療或精準醫療治療食管癌的話，就要另當別論，個體化對待了。

［1］Jemal A， Bray F， Center MM， et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin， 2011，61（2）： 69-90.

［2］Doerks T. Control of translation and mRNA degradation by miRNAs and siRNAs. Genome Res， 2002， 12（1）： 47-56.

［3］Calin GA， Sevignani C， Dumitru CD， et al. Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. Proc Natl Acad Sci U S A， 2004， 101（9）：2999-3004.

［4］Kan TMeltzer SJ. MicroRNAs in Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Curr Opin Pharmacol， 2009， 9（6）： 727-732.

［5］Guo Y， Chen Z， Zhang L ZF， et al. Distinctive microRNA profiles relating to patient survival in esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Res， 2008， 68（1）： 26-33.

［6］Li Y， Tan W， Neo TW， et al. Role of the miR-106b-25 microRNA cluster in hepatocellular carcinoma. Cancer Sci， 2009， 100（7）：1234-1242.

［7］Andrew Feber P， Liqiang Xi， James D. et al. MicroRNA Expression Profiles of Esophageal Cancer. J Thorac Cardiovasc Surg，2008，135（2）：255-260.

Objective： To investigate the different roles miR-25 play in invasion and metastasis of EC109 and KYSE150. Methods： To inhibit and overexpress miR-25 by transfecting miRNA inhibitor and miRNA mimic into human esophageal carcinoma cells KYSE150 and EC109， then study the function miR-25 plays in different groups of cells through Transwell migration assay and Transwell invasion assay， finally analyse the data of different groups. Results：Overexpressing miR-25 by miRNA mimic led to increased cell migration and invasion in both KYSE150 and EC109； supressing miR-25 resulted in decreased cell migration and invasion in KYSE150， whereas the difference wasn't obvious in EC109. Conclusion： miR-25 promotes invasion and metastasis of esophageal squmous cancer， inhibitting miR-25 may have different influence in different kind of cells.

esophageal； cancer/carcinoma； invasion； migration

國家自然科學基金（81460059）；兵團衛生科技-兵團博士基金（2014BB019）

?通訊作者：魏育濤（1976- ），男，漢族，新疆石河子人，副主任醫師，博士，主要從事食管癌及心臟瓣膜疾病的研究。作者簡介：宋亞芹（1989-），女，漢族，山東濟寧人，碩士在讀，主要從事食管癌的研究。