生長期RNAi抑制POD基因表達對心里美蘿卜花青素含量的影響

李日輝

（新鄉醫學院三全學院，河南新鄉 453000）

生長期RNAi抑制POD基因表達對心里美蘿卜花青素含量的影響

李日輝

（新鄉醫學院三全學院，河南新鄉 453000）

前期結果表明，在生長期通過RNAi可有效地抑制其POD基因的長期表達，但對72h內的變化無從了解。本實驗模擬心里美蘿卜自然生長條件，在前期研究基礎上進行RNAi干擾POD基因表達，進一步證實POD活性被抑制的時間可以提前到RNAi干擾質粒作用后的4h，而花青素的含量隨POD活性被抑制而逐漸增加。同時植物的生長狀態可以影響到干擾強弱，對干擾趨勢影響不明顯。

POD rsprx1基因 RNAi 花青素

心里美蘿卜（Raphanus sativus L）屬十字花科、兩年生草本植物，是我國著名的蘿卜品種，其肉質根的木質部中含有豐富的過氧化物酶和花青素。過氧化物酶（Peroxidase，POD）是廣泛存在于植物體內的一類能利用H2O2氧化供氫體的酶，它對H2O2具有高度專一性，而對供氫體的要求則較為廣泛，它催化如下反應：A H+ H2O2=A+2H2O［1］。由于POD成分和結構的復雜性，同功酶的多樣性，以及多基因編碼特點，造成對其功能的認識尚不全面。POD一方面與植物正常的形態發生和形態建成有關，在植物的生長、發育過程中起作用；另一方面與植物的抗逆性有關，包括抗旱、抗寒、抗鹽和抗病等，是植物重要的保護酶。

花青素（Anthocyanidin），又稱花色素，是苯并吡喃衍生物，常與一個以上葡萄糖、鼠李糖等通過糖苷鍵形成花青苷（Anthocyanin）。花青素主要存在于植物液泡中，水果、蔬菜、花卉等五彩繽紛的顏色大部分與之有關，也是樹木葉片的主要呈色物質。花青素具有抗氧化、消除自由基、抗變異、抗腫瘤、降低血清和肝臟中脂肪含量以及防止人體內過氧化的作用。植物花青素代謝途徑研究已較為成熟，苯丙氨酸是花青素合成的直接前體，由苯丙氨酸到花青素經歷3個階段：第1階段由苯丙氨酸到香豆酰CoA；第2階段是由4-香豆酰CoA和丙二酰CoA到二氫黃酮醇，是類黃酮代謝的關鍵反應；第3階段是花青素的合成 。通過外源結構基因的導入，利用共抑制原理等技術調控花青素等類黃酮物質的合成，以改變植物花色、果色和葉色已經取得了許多成果。RNAi技術已經成功應用到通過抑制花青素合成基因來改變花的顏色，創造出新的植物品種這一領域上來。

1 材料與方法

1.1 材料

心里美蘿卜品種為京研牌“滿堂紅”菌株：含有pART-rsprx1i干擾載體的農桿菌菌株和含有空載體pART-27的農桿菌菌株，由本實驗室保存。

圖1 抑制rsprx1基因對POD活性的影響

圖2 抑制rsprx1基因對花青素含量的影響

圖3 各組花青苷相對含量比例示意圖

1.2 方法

（1）浸染。將含有干擾載體pART-rsprx1i和空質粒pART-27的農桿菌在含有50mg/L卡那霉素（Kan）的LB固體培養基上分別劃線培養，長出菌落后，挑取單菌落接種于附加50mg/L卡那霉素（Kan）的LB液體培養基中，培養48h左右，使OD達到0.8。用含有10mmol/L MES和2%蔗糖、pH為5.6的1/2MS液體培養基做為細胞重懸液，重懸菌液至OD為2.4。取生長至65天、79天和93天的心里美蘿卜去皮，滅菌后切成0.5cm3，用含有pART-rsprx1i的菌液浸泡10min，并以含有pART27的農桿菌及清水做對照，浸泡時置于搖床。浸泡后置于培養皿，在培養箱中進行培養，培養箱的光照強度為12000LX，溫度為24°C。培養4h、8h、24h、48h和72h后測定各指標。

（2）POD活性的檢測。稱0.9g肉質根，加入適量石英砂及0.9 ml PB ［50mmol/L （pH7.0）］，低溫下勻漿，12000r/min離心20 min。參照張龍翔等方法［3］，取上清10μl，加入2.9 ml 0.01mol/L PB，并加入50μl 0.02mol/L愈創木酚，最后加入10μl 0.04mol/L新配制的H2O2后470nm處比色，每隔30秒測定OD，連續記錄3min，以光吸收每分鐘增加0.001為一個酶活性單位（U），酶活性用U/g·FW表示。

（3）花青素含量的測定取0.3g肉質根，加少量石英砂和0.9 ml提取液（含1%濃鹽酸的無水乙醇），研磨至勻漿，在4°C冰箱避光浸提24h，加等體積蒸餾水1.8 ml，12000 r/min，4°C離心10 min，于520nm處測定吸光值，含量單位用A520/g·FW表示。

（4）花青素高效液相色譜分析。取培養48h的蘿卜肉質根，切碎后稱取1g蘿卜肉質根，加入2ml的5%甲酸充分研磨，浸提12h后，8000r/m，離心15min，收集上清。HPLC使用C18柱，柱溫40°C，流動相A為5%甲酸，流動相B為5%乙腈/甲酸，流速0.4 ml/min，進樣量為20μl，檢測波長為520nm，采用梯度洗脫。

2 結果

（1）生長期抑制rsprx1基因對POD活性的影響在不同生長期，其肉質根經含有pART-rsprx1i干擾載體的農桿菌浸染10 min，并以含有空質粒pART-27的農桿菌及清水做對照，培養至48h，POD活性均達到組內最低值，以48h為組間比較時間點，如圖1：在播種后的第65、79和93天，肉質根經含有干擾載體的菌液浸染10 min，培養至48h，POD活性均達到最低且與對照組有極顯著差異（p＜0.01）；播種后第79天，處理后48h，抑制組POD活性14.2×103U/g·FW，為組內組間最低值。

（2）生長期抑制rsprx1基因對花青素含量的影響以48h為組間比較時間點，花青素含量測定如圖2：在播種后的第79天，其肉質根小塊經含有pART-rsprx1i干擾載體的農桿菌浸染10 min，培養至48h后，花青素含量達到最高且與對照組有極顯著差異（p＜0.01）；第65天時抑制組花青素含量與清水組有極顯著差異（p＜0.01），與轉空質粒組有一般顯著差異（p＜0.05）；第93天時抑制組花青素含量與清水組有一般顯著差異（p＜0.05）；播種后第79天，處理后48h，抑制組花青素含量為12.3 A520/g·FW，為組內組間最大值。

（3）花青素高效液相分析對上述花青素進行HPLC，從蘿卜肉質根中共分離出了26種花青苷，它們主要為天竺葵素的衍生物，抑制組各花青苷的含量和表達量高于兩個對照組，有極顯著差異（P＜0.01）。其中第14、16、18、25號所代表的花青苷在抑制組中的相對表達量要低于對照組；而抑制組中的第3、13、15、17號所代表的花青苷相對表達量則要高于對照組；從花青苷的種類來說，抑制組和與對照組的花青苷成分有明顯差異，其中，抑制組檢測出花青苷26種，轉空質粒組檢測出23種，而在清水組檢測出24種，如圖3所示。

3 結語

在心里美蘿卜生長的不同時期，采取對肉質根進行轉染，POD活性的抑制作用最強效果是在蘿卜播種后生長至第79天的時期。浸染后培養48h POD活性達到最底點，至72h時抑制作用有減低趨勢。

浸染法會對植物組織造成一定程度的損傷，同時農桿菌本身也會對植物組織造成病害。在本實驗中沒有進行愈傷培養，但從實驗結果可見，無論那種處理，清水對照組的POD活性和花青苷含量在研究中變化不明顯，同時以清水對照的數據作為參考，可以排除機械損傷對實驗結果的影響［5］。

在蘿卜營養生長期肉質根POD活性有一個先升高后下降的過程，而花青素含量變化則是逐漸升高然后相對穩定。心里美蘿卜肉質根花青素的合成主要是在其營養生長早期，而后期主要是花青素的積累.在富含花青素的植物器官伴隨有高活性的POD，POD在體外可以降解花青素，抑制POD可延緩花青素降解。在本實驗中過氧化物酶的活性減低和花青素含量的增高位于同一時間點，進一步證明過氧化物酶在花青素代謝中的作用。抑制rsprx1基因的表達，降低POD含量和活性，可以增加轉錄因子TT8表達，進而增加CHS，CHI，DFR和LDOX基因的表達，從而使花青素合成增加。參與花青素合成途徑的基因很多，干擾rsprx1并不能影響所有花青素合成基因，只是選擇性影響部分基因表達［6］。從實驗結果可以得出初步推論：過氧化物酶對花青素的作用不僅體現在影響花青素合成相關基因的表達，還能在花青苷修飾方面影響其?；?。

［1］Penel C.The peroxidase system in higher plants.In： Greppin H， Penel C， Integrated Plant Systems ［J］.University of Geneva，Switzerland，2000，pp：359-367.

［2］張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實驗方法和技術［M］.第2版.北京：高等教育出版社，1997，188-189.

［3］Sharp P A. RAN interference［J］.Genes Dev，2001，15（5）：485-490.

［4］楊少華.轉蘿卜過氧化物酶RsPrx1基因影響擬南芥花青素代謝機理［D］.河南：河南師范大學，2010.

［5］Holton T A，Cornish E C. Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis ［J］.Plant Cell，1995，7：1071-1083.