pH敏感型K5多糖-阿霉素前體藥物的制備及其性能

劉文，張苗，陳荊曉，陳敬華

（江南大學藥學院，江蘇無錫 214122）

pH敏感型K5多糖-阿霉素前體藥物的制備及其性能

劉文，張苗，陳荊曉，陳敬華*

（江南大學藥學院，江蘇無錫 214122）

利用肝素前體K5多糖，通過腙鍵（Hydrazone bond）連接抗腫瘤藥物阿霉素（DOX），制備具有pH敏感性的K5-hydrazone-DOX（KHD）前體藥物。對其載藥量、形貌和體外藥物釋放等性質進行了研究，并通過HeLa細胞對其體外細胞毒性和細胞攝取進行了評價。結果表明，所制備的KHD前體藥物中，DOX質量分數為18.0%。藥物釋放結果顯示，KHD前體藥物在pH 5.0條件下對DOX的釋放率遠高于pH 7.4條件下的釋放率，具有明顯的pH響應性。細胞實驗表明，KHD前體藥物可迅速被細胞攝取，并且具有腫瘤細胞抑制作用。本研究結果表明，KHD是一種有潛在應用價值的抗腫瘤前體藥物。

K5多糖；前體藥物；pH敏感；藥物傳遞

抗腫瘤前體藥物由聚合物和抗腫瘤化合物通過可斷裂化學鍵連接獲得，可以在分子水平提高化療藥物的溶解度、穩定性和半衰期［1-3］。制備前體藥物的材料包括合成高分子材料和天然高分子材料。多糖作為一種可生物降解的天然高分子材料，具有良好的生物相容性、水溶性等優點，近年來在藥物載體研制領域受到廣泛關注［4-5］。

K5多糖作為肝素合成的前體化合物，具有生物相容性高、無免疫原性、在體內可被降解代謝等優點［6-9］。與肝素相比，未硫酸化的K5多糖不具有抗凝血活性，可避免產生出血等副作用［10］。K5多糖易被細胞攝取，用作藥物載體可將藥物迅速轉運至細胞內［11-12］。帶負電荷的K5多糖在血液中可避免因血漿蛋白質的吸附而被清除。K5多糖易被細胞攝取的特性以及其負電性，使其有望成為將藥物有效輸送至靶細胞內的新型藥物載體。

本文作者以K5多糖為聚合物載體，通過pH敏感腙鍵與阿霉素連接，設計并制備了pH敏感的KHD前體藥物，對該前體藥物的理化性質、不同pH條件下的藥物釋放行為、體外抗腫瘤活性和細胞攝取等性能進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑鹽酸阿霉素（DOX·HCl），購自浙江海正制藥有限公司；己二酸二酰肼（ADH），購自阿拉丁試劑有限公司；二甲亞砜（DMSO），噻唑藍（MTT），1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl），購自上海生工生物工程公司；透析袋（截留分子量：3 500 Da），胰酶，購自Sigma-Aldrich公司；雙抗（100 U/mL青霉素、100 μg/ mL鏈霉素），RPMI 1640細胞培養基，購自Gibco Invitrogen公司；胎牛血清（FBS），購自Hyclone公司；其它試劑均為國產分析純。

1.1.2 儀器U-008OD紫外分光光度計，日本Hitachi公司制造；AVANCE III全數字化核磁共振譜儀，德國Bruker公司制造；JEM-2100型透射電鏡，日本JEOL公司制造；Zetasizer Nano ZS納米粒度與Zeta電位分析儀，英國Malvern公司制造；CO2細胞培養箱，美國Thermo公司制造；DMIL LED倒置熒光顯微鏡，德國Leica公司制造；MULTISKAN GO酶標儀，美國Thermo公司制造。

1.1.3 菌株與細胞株大腸桿菌K5菌株，購自ATCC；人類宮頸癌細胞（HeLa），購自中國科學院保藏中心（上海）。

1.2 KHD的合成

1.2.1 K5-ADH的合成K5多糖通過發酵大腸桿菌K5菌株，經提取純化獲得，相對分子質量約為10 000。稱取200 mg K5多糖，溶于20 mL去離子水，加入220 mg己二酸二酰肼（ADH），攪拌溶解，用0.1 mol/L HCl溶液調pH至4.5左右，加入24 mg EDC·HCl，室溫下攪拌反應4 h。反應結束用0.1 mol/L NaOH溶液調pH至7.0，去離子水充分透析，凍干得K5-ADH。

1.2.2 KHD的合成及表征將DOX·HCl溶于DMSO后加入無水三乙胺脫鹽酸，得DOX。稱取150 mg K5-ADH溶于50 mL甲酰胺，加入DOX溶液，避光條件下室溫攪拌反應48 h，去離子水透析，凍干得KHD。產物KHD通過核磁共振氫譜（1H NMR）確認其結構，根據阿霉素標準曲線測定并計算KHD中DOX的含量。DOX摩爾分數

1.3 KHD納米粒子的制備及表征

制備KHD水溶液（1 mg/mL），靜置1 h后滴在銅網上，自然干燥后，用磷鎢酸負染，再自然干燥。將樣品置于透射電鏡下觀察。

將KHD溶于超純水（1 mg/mL），于25℃條件下測定KHD納米粒子的粒徑分布和Zeta電位。

1.4 體外藥物釋放

采用透析法測定DOX在體外的釋放情況，稱量一定量KHD用PBS（pH 7.4）溶解，分別置于截留相對分子質量為3 500的透析袋中，之后放入分別裝有10 mL pH 5.0、pH 7.4 PBS的棕色瓶中。避光放入37℃搖床中，轉速100 r/min，并于設定時間點取樣。所取樣品在480 nm處測其紫外吸收，根據阿霉素標準曲線計算各個時間點的累積藥物釋放率。

1.5 體外細胞毒性

細胞培養：細胞培養條件采用含體積分數10% FBS、質量分數1%雙抗的RPMI 1640細胞培養基，在37℃、質量分數5%CO2及飽和濕度的條件下連續培養及傳代。

將細胞接種至96孔培養板，細胞密度7 000個/孔，在37℃、質量分數5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養24 h。加藥組加入各受試藥物（K5多糖、阿霉素、KHD分別以不同濃度溶于含體積分數10%FBS的細胞培養基中），空白組只加含體積分數10%FBS的細胞培養基。分別繼續培養24 h和48 h后每孔加入0.5 mg/mL MTT溶液100 μL，37℃培養4 h，吸出上清液，用100 μL DMSO溶解沉淀物，使用酶標儀在570 nm處檢測OD值。細胞存活率

1.6 體外細胞攝取

將HeLa細胞以25 000個/孔的密度接種于24孔板中，培養24 h，吸去培養基，分別加入500 μL游離DOX和KHD培養基溶液（其中DOX的濃度為5 μmol/L），培養1 h后，于倒置熒光顯微鏡下觀察藥物的細胞內攝化。

2 結果與分析

2.1 KHD前體藥物的合成

K5多糖糖鏈上含大量羧基，在EDC的催化下與ADH一端的氨基發生反應，生成K5-ADH中間體，K5-ADH中ADH另一端聯氨基與阿霉素的13位羰基在常溫下可直接發生反應，形成pH敏感的腙鍵，得到KHD前體藥物（圖1）。

圖1 KHD的合成路線Fig.1Synthetic route of KHD

如圖2所示，KHD前體藥物的核磁氫譜圖與K5多糖相比，K5多糖的特征峰仍存在，出現在δ 1.5和δ 2.2處的共振峰為ADH中質子氫的峰，在δ 8處的共振峰為DOX蒽環上質子氫的峰，表明已成功制備了KH

圖2 K5多糖（A）與KHD（B）核磁氫譜Fig.21H NMR of K5 polysaccharide（A）and KHD（B）

利用阿霉素在480 nm處較強紫外吸收，通過阿霉素在480 nm處的標準曲線計算得KHD中DOX摩爾分數為18.0%。

2.2 KHD的形貌

由于K5多糖和ADH具有良好的水溶性，而連接至K5多糖的DOX分子結構中的蒽環在pH 7.4條件下具有疏水性，因此KHD表現出兩親性，在水溶液中能夠通過疏水作用力自組裝形成納米粒子。透射電鏡結果表明，形成的納米粒子為邊緣模糊的球狀納米粒子，并且具有良好的分散性、尺度均一，平均粒徑約為36 nm，如圖3（a）所示。

納米粒子的粒徑大小影響其微粒的分散穩定性以及在體內的分布，KHD納米粒子的粒徑通過動態光散射（DLS）進行測定，結果如圖3（b）所示。

可以看出，KHD在水溶液中組裝得到的納米粒子的平均粒徑為64 nm，PDI=0.178，表明其具有較窄的粒徑分布。粒徑儀所測納米粒子在水溶液中的粒徑大于透射電鏡測得的粒徑，是因為透射電鏡所測納米粒子為干態。KHD納米粒子Zeta電位為（-20±1.5）mV，這是因為納米粒子表面為親水性的K5多糖，而其分子中含有大量羧基，導致納米粒子表面為負電性質。由Zeta電位值可知，KHD納米粒子具有較好的穩定性，不易聚集，這一結果也與TEM觀測結果一致。

圖3 KHD納米粒子的透射電鏡圖及其粒徑分布Fig.3TEM image and size distribution of KHD nanoparticles

2.3 體外藥物釋放

KHD的體外藥物釋放實驗在不同pH值條件下進行。如圖4所示，KHD納米粒子在不同pH條件下DOX的釋放有明顯區別，50 h后，pH 7.4時的累積釋放率約30%；pH 5.0時，DOX的累積釋放率達65%。在pH 5.0酸性條件下，DOX具有較快的釋放速率。這是因為KHD分子中的腙鍵在酸性條件下會斷裂，釋放出自由的DOX分子。DOX在低pH條件下的溶解性增強，有利于其從透析袋中游離出來。pH依賴的DOX釋放有利于增強靶向抗腫瘤的效果，在生理pH條件下的緩慢釋放確保了KHD納米粒子在血液循環系統中的完整性，降低了對正常組織的毒性；在低pH的腫瘤組織和內涵體/溶酶體中可快速釋放，發揮其抗腫瘤活性。

圖4 37℃時KHD在pH 7.4和pH 5.0環境下的體外藥物釋放（n=3）Fig.4In vitro drug release from KHD nanoparticles at 37℃under pH 7.4 and pH 5.0（n=3）

2.4 KHD的體外細胞毒性

如圖5所示，K5多糖與HeLa細胞共孵育48 h后未表現出明顯毒性，細胞存活率均大于85%，即使在400 mg/L較高質量濃度下細胞仍可保持較高的存活率。這一結果說明K5多糖具有良好的生物相容性，是安全的藥物載體。

圖5 K5多糖對HeLa細胞的體外細胞毒性（n=4）Fig.5In vitro cytotoxicity of K5 polysaccharides against HeLa cells with increasing concentrations（n=4）

采用MTT法檢測KHD納米粒子的細胞毒性，結果如圖6所示。可以看出，共培養24 h后，KHD納米粒子對HeLa細胞的半數抑制質量濃度（IC50）為2.2 mg/L，游離阿霉素對細胞的抑制作用較弱。共培養48 h后，KHD納米粒子對HeLa細胞的IC50為1.3 mg/L，游離阿霉素對HeLa細胞的IC50為2.7 mg/ L，KHD納米粒子對細胞增殖的抑制作用仍明顯高于阿霉素。

由圖5和圖6可知，K5多糖對細胞增殖無抑制作用，KHD納米粒子的細胞毒性是由其所載的DOX決定的。KHD納米粒子在短時間內的高細胞毒性表明，有較多的DOX在短時間內被運載至細胞內。以K5多糖為載體的KHD前體藥物可在較短時間內明顯抑制細胞增殖，此結果與作者在文獻［12］中所報道的結論相吻合。

圖6 游離阿霉素與KHD納米粒子對HeLa細胞24 h和48 h的體外細胞毒性（n=4）Fig.6In vitro cytotoxicity of free DOX and KHD nanoparticles against HeLa cells with increasing DOX concentrations after 24 h and 48 h（n=4）

2.5 KHD體外細胞攝取

如圖7（a）所示，KHD納米粒子與細胞在37℃條件下孵育1 h后，可以看到在細胞內有明顯的紅色熒光，且其熒光強度明顯高于相同含量的游離阿霉素對照組的熒光強度（圖7（b）），說明KHD納米粒子能快速被細胞攝取并在細胞內累積。KHD納米粒子快速有效地將所載阿霉素運載至細胞內，使所載藥物迅速達到有效濃度，抑制細胞增殖，與KHD納米粒子可在短時間內達到較高的細胞毒性結果相吻合。

圖7 HeLa細胞對游離阿霉素和KHD納米粒子的攝取（比例尺：50 μm）Fig.7Cellular uptake of free DOX and KHD nanoparticles（Scale bar：50 μm）

3 結語

本課題研究中采用易被細胞攝取的K5多糖為載體，成功制備了pH敏感的KHD前體藥物，在水溶液中可自組裝形成形態大小均一且分散性良好的納米粒子。KHD納米粒子在低pH條件下DOX的釋放率明顯高于pH 7.4條件下DOX的釋放率，表現出pH敏感特性。細胞攝取結果表明，KHD納米粒子可快速有效地被細胞攝取，從而表現出較強的細胞毒性，為抗腫瘤前體藥物的研究提供了全新的思路。

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Preparation and Property Study of the pH-Sensitive K5 Polysaccharide-Doxorubicin Prodrug

LIU Wen，ZHANG Miao，CHEN Jingxiao，CHEN Jinghua*
（School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

In this study，K5 polysaccharide（heparosan）was conjugated with anticancer drug DOX via hydrazone bond to obtain pH-sensitive K5-hydrazone-DOX（KHD）prodrug.The drug loaded capacity，morphology，and in vitro drug release were investigated.Its in vitro cytotoxicity and cellular uptake against HeLa cells were also evaluated.The results showed that the DOX content of KHD is 18.0%.The release rate of DOX at pH 5.0 was much faster than that at pH 7.4，revealing a pH-triggered release manner.The KHD prodrug could achieve intracellular delivery and showed effective cytotoxicity in vitro.This study indicates that the KHD prodrug may be a potential candidate for cancer therapy.

K5 polysaccharide，prodrug，pH-sensitive，drug delivery

R 944.9

A

1673—1689（2015）06—0634—06

2014-05-06

教育部高等學校博士學科點專項科研基金項目（20110093110008）；江蘇省自然科學基金項目（BK2012557）；武漢大學生物醫用高分子材料教育部重點實驗室開放基金項目（20110401）。

*通信作者：陳敬華（1971—），男，湖北黃石人，理學博士，教授，博士研究生導師，主要從事生物大分子和生物功能材料的研究。E-mail：jhchenwhut@126.com