直擴法檢驗新鮮煙蒂DNA的最佳檢驗部位

莆田市公安局物證鑒定所 叢雪塵 方愛瓊 方 茜

Identifiler Plus試劑盒在產品定位上雖不屬于直擴試劑盒，但因其具有抗抑制能力強等特點，也具有直擴的潛力。關于 Identifiler Plus應用于不同類型的現場檢材直擴檢驗的可行性和有效性，已經有文獻予以報道，用其對現場血樣進行直擴檢驗的成功率和用 Identifiler-Direct進行直擴檢驗的成功率無顯著差異，用其對現場煙蒂及擦拭物進行直擴檢驗的成功率甚至遠遠高于用 Identifiler-Direct進行直擴檢驗的成功率[1]，這進一步表明Identifiler Plus應用于直擴時表現良好。對于煙蒂的 DNA檢驗，有研究指出，當煙蒂放置時間超過一周時，檢出率就將隨著放置時間的增長而大幅下降，且在用Chelex-100方法提取煙蒂DNA時，提取煙紙上DNA的檢出率要大大高于提取海綿上DNA的檢出率[2]，而在煙紙中加入海綿對檢出率沒有顯著影響[3]。筆者認為，該結論是否同樣適用于直擴法還需進一步驗證，且該驗證非常有必要，因為這對日常檢案將帶來很大幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

50個煙蒂均來源于志愿者，為新鮮煙蒂。

1.2 儀器與試劑

采用ABI-9700型PCR儀進行擴增，ABI-3130XL型遺傳分析儀進行測序；擴增試劑使用美國 ABI公司生產的Identifiler Plus 試劑盒。

1.3 方法

分為直擴組和對照組兩組。直擴組分別剪取每枚煙蒂唾液斑痕處的外層煙紙約 2mm×1mm、海綿約 2mm×0.5mm、以及兩者混合物，剪碎后留待擴增。擴增試劑采用Idnetifiler Plus試劑盒，擴增反應體系為25μL，反應體系配比與擴增參數均參照操作說明書推薦參數設置。對照組按上述方法剪取相同檢材的煙紙海綿混合物，DNA提取采用行標GA/T383-2014中的Chelex-100方法，擴增試劑亦使用Idnetifiler Plus試劑盒，25μL反應體系，反應體系配比與擴增參數設置同直擴組。以上兩組電泳測序信息均由Data Collection 3.0數據收集軟件自動收集，采用GeneMapperID v3.2軟件進行基因分型。

2 結果

從檢驗結果看，煙紙的直擴檢出成功率僅為12%，海綿的檢出成功率高達96%，與對照組的檢出率（98%）相比無顯著差異，在海綿中加入煙紙對檢驗結果無顯著影響（見表1）。對海綿進行直擴檢驗所獲得的STR分型與用對照組相比無顯著差異，但對照組圖譜的等位基因間均衡性要稍好，STR分型比較見圖1～圖3。

表1 三種檢驗部位的STR分型結果比較

圖1 煙紙直擴STR分型結果

圖2 海綿直擴STR分型結果

圖3 對照組STR分型結果

3 討論

從檢驗結果看，對新鮮煙蒂進行直擴檢驗時，應選取煙蒂的海綿部分，而非煙紙部分。用直擴法檢驗煙蒂海綿是可行的，結果是可信的，且省去 DNA提取步驟，既節省了檢驗時間又減少了潛在的污染環節。一些學者認為，海綿中的纖維上含有PCR抑制物，會導致PCR擴增效率低[2]，[4]，但另一些實驗[3]則表明，在煙紙中加入煙絲會導致檢驗失敗，而加入海綿則不影響檢驗結果。筆者認為，海綿纖維本身對PCR的抑制作用并不顯著，而煙絲中則存在大量 PCR抑制物，只是由于吸煙者在吸煙過程中，過濾嘴海綿上可能吸附了大量煙絲燃燒殘留物，煙紙上吸附的則比較少，所以當使用抗抑制能力不強的擴增試劑盒來檢驗海綿時，很難得到滿意的結果。Identifiler Plus試劑盒的突出特點便是抗抑制能力強，所以用其來做直擴實驗時，反而可能由于吸附在海綿上的脫落細胞比吸附在煙紙上的脫落細胞更容易浸泡脫落，從而檢驗海綿的成功率遠遠高于檢驗煙紙的成功率。對于陳舊煙蒂，吸附在煙紙和海綿上的脫落細胞更難浸泡脫落，是否適用直擴法檢驗還需驗證。在本次研究中，雖然檢驗海綿的檢出成功率很高，但所獲得STR分型的峰高及等位基因間均衡性還不甚理想，改良擴增反應體系或許會獲得更好的結果。在對新鮮煙蒂進行直擴時，還需注意，在剪取海綿時，應選取唾液斑痕較明顯處剪取，增加模板濃度可有效提高檢出成功率；由于海綿的延展性較好，在擴增前應注意將剪取的檢材完全浸沒在反應液中，避免因檢材漂浮在液面導致檢驗失敗。

[1]哈飛，孫紅兵，高海鵬，等.現場生物檢材Identifiler Plus直接擴增方法的應用研究[J].中國優生與遺傳雜志，2013,21（12）：33-34.

[2]張愛平，陳曉輝，劉長暉，等.放置時間對煙蒂上DNA含量及STR分型的影響[J].法醫學雜志，2008,24（6）：423-424.

[3]張慶霞，劉雅誠，唐暉，等.煙蒂DNA分型的研究[J].中國法醫學雜志，2003,18（1）：29-30.

[4]陳向紅，劉超，李越.熒光標記STR分型進行煙蒂的個人識別[J].中國法醫學雜志，2002,17（5）：301-302.