烏司他丁聯合異甘草酸鎂對肺纖維化大鼠肺組織TGF-β1和CTGF表達的影響

劉偉偉，聶衛，袁玲，鄭洪，崔曉雪，沈洪昇，劉大衛

實驗研究

烏司他丁聯合異甘草酸鎂對肺纖維化大鼠肺組織TGF-β1和CTGF表達的影響

劉偉偉1，聶衛1，袁玲1，鄭洪2，崔曉雪1，沈洪昇1，劉大衛1

目的觀察烏司他丁聯合異甘草酸鎂對博萊霉素（BLM）誘導的肺纖維化大鼠肺組織轉化生長因子β1（TGF-β1）和結締組織生長因子（CTGF）表達的影響。方法90只大鼠隨機分為以下5組：BLM組、甲潑尼龍琥珀酸鈉（MTH）組、烏司他丁（UTI）組、異甘草酸鎂（MgIG）組、烏司他丁聯合異甘草酸鎂（UTI+MgIG）組，各18只。5組均以氣管內注入BLM建立大鼠肺纖維化模型，造模成功24 h后，BLM組大鼠每日腹腔注射生理鹽水，其余各組給予相應藥物腹腔注射。每組分別于第7、14和28天處死6只，HE染色評價肺組織肺泡炎及纖維化程度，免疫組化測定肺組織TGF-β1和CTGF的表達水平。結果（1）藥物干預各組肺泡炎及肺纖維化程度均較BLM組有所減輕，其中UTI+MgIG組第7、14天肺泡炎程度，第14、28天肺纖維化程度與BLM組差異有統計學意義（P＜0.05）。（2）藥物干預各組TGF-β1和CTGF的表達水平在各時間點均較同期BLM組有所降低；UTI+MgIG組TGF-β1的表達水平在第7、14天時明顯低于UTI組和MgIG組，第28天時明顯低于MTH組、UTI組和MgIG組（P＜0.05）；UTI+MgIG組CTGF的表達水平在第7天時明顯低于UTI組和MgIG組，第14、28天時明顯低于MTH組、UTI組和MgIG組（P＜0.05）。結論UTI聯合MgIG能減輕BLM誘導的大鼠肺泡炎及纖維化程度，其機制可能與下調TGF-β1和CTGF的表達有關。

肺纖維化；轉化生長因子β1；大鼠，Wistar；結締組織生長因子；烏司他丁；異甘草酸鎂

特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種原因不明、以進展性的肺纖維化炎癥反應為特征的肺間質疾病，其發病率約為10/10萬，且呈逐年增長的趨勢［1］。IPF可見于各年齡組，預后不良，中位生存期僅3年［2］。由于IPF病因不明，發病機制不詳，明確診斷受到限制，缺乏有效的治療藥物，所以預后不佳。烏司他丁（UTI）和異甘草酸鎂（MgIG）均有抑制炎癥介質過度釋放、抗氧化、抗纖維化、穩定細胞膜及免疫調節等作用。轉化生長因子β1（TGF-β1）是最重要的致纖維化因子，且結締組織生長因子（CTGF）是TGF-β1的下游因子，兩者關系密切。本研究擬觀察UTI聯合MgIG注射液對博萊霉素（bleomycin，BLM）誘導的肺纖維化大鼠肺組織病理學變化及肺組織TGF-β1和CTGF表達的影響，探討UTI聯合MgIG治療肺纖維化的作用機制，為肺纖維化的防治提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料（1）實驗動物。清潔級雌性Wistar大鼠90只，體質量240～260 g，平均（251.4±3.6）g，購自解放軍軍事醫學科學院衛生與醫學研究所動物實驗中心。許可證號：SCKK-（年）2009-003。合格證號0001654。（2）主要試劑和儀器。注射用鹽酸博萊霉素（日本化藥株式會社）；注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（Pfizer Manufacturing Belgium NV）；注射用烏司他丁、異甘草酸鎂注射液（廣東天普生化醫藥股份有限公司）；兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體和兔抗大鼠CTGF多克隆抗體，SABC試劑盒及DAB顯色劑（武漢博士德生物工程有限公司）；尼康Ci-L圖像采集顯微鏡（Nikon Corporation）；IDA-2000高清度數碼顯微圖像分析系統（中科院北京空海科技發展有限公司）。其他試劑均為國產或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 動物分組將90只SD大鼠用隨機數字表法分為BLM組、甲潑尼龍琥珀酸鈉組（MTH組）、烏司他丁治療組（UTI組）、異甘草酸鎂治療組（MgIG組）、烏司他丁聯合異甘草酸鎂治療組（UTI+MgIG組），各18只。

1.2.2 動物模型的建立及藥物干預10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，常規消毒頸部，切開皮膚，鈍性分離，暴露氣管，緩慢注入BLM 5 mg/kg。注藥完畢后立即直立并旋轉大鼠，使藥液在肺內均勻分布。氣管內灌注BLM復制肺纖維化大鼠模型成功24 h后，各組給予藥物腹腔注射，BLM組生理鹽水1 mL，每日1次。MTH組甲潑尼龍琥珀酸鈉4.5 mg/kg，每日1次。UTI組烏司他丁2萬U/kg，每日2次。MgIG組每日腹腔注射異甘草酸鎂30 mg/kg，每日1次。UTI+MgIG組每日腹腔注射異甘草酸鎂30 mg/kg，每日1次和烏司他丁2萬U/kg，每日2次。各給藥劑量均相當于成人給藥量。

1.2.3 肺組織的處理各組手術后第7、14、28天分3批各處死6只。切除右肺，浸入10%中性福爾馬林中固定4 h以上，常規脫水、透明、浸蠟、包埋后連續切片，切片厚度為5 μm，并進行HE染色及觀察。按Szapiel等提出的方法評價肺泡炎及肺纖維化程度。肺泡炎：0級（0分）無肺泡炎；Ⅰ級（1分）輕度肺泡炎，單核細胞浸潤使肺泡間隔增寬，僅局限于局部或胸膜部，面積小于全肺的20%，肺泡結構正常；Ⅱ級（2分）中度肺泡炎，受累面積占全肺的20%～50%，近胸膜部較重；Ⅲ級（3分），重度肺泡炎，面積大于50%。肺纖維化：0級（0分）無明顯改變；Ⅰ級（1分）輕度改變，病變范圍小于全肺的20%；Ⅱ級（2分）中度改變，病變范圍占全肺的20%～50%；Ⅲ級（3分），重度改變，病變范圍占全肺的50%以上，肺泡結構紊亂。

1.2.4 免疫組織化學染色TGF-β1和CTGF兔多克隆抗體工作濃度1∶50，用PBS代替第一抗體作為空白對照。切片厚度均為5 μm，常規石蠟切片脫蠟至水；3%H2O2封閉內源性過氧化物酶；微波加熱修復抗原；滴加TGF-β1或CTGF抗體；4℃過夜；加入二抗；DAB顯色，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每張切片在200倍鏡下隨機讀取5個視野，用HMIAS-2000高清晰度彩色醫學圖文分析系統分析，取平均吸光度值進行統計分析。

1.3 統計學方法采用SPSS17.0進行分析，計量資料用均數±標準差表示。多組間均數比較行方差分析和LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色BLM組：第7天，肺泡間隔增寬、肺泡腔及肺泡間隔內可見大量淋巴細胞、中性粒細胞及巨噬細胞浸潤，少量成纖維細胞及毛細血管增生，病灶內部分肺泡萎陷；第14天肺泡炎性滲出逐漸減輕，肺泡間隔明顯增厚，成纖維細胞增多，肺內纖維組織增生；第28天肺泡結構嚴重破壞、纖維組織大量增生，纖維化明顯加重。藥物干預各組各時間點炎癥細胞滲出及纖維組織增生程度較同期BLM組均有所減輕，其中UTI+MgIG組病變減輕程度較明顯，見圖1。第7、14天時，藥物干預各組大鼠肺泡炎程度均輕于BLM組，其中UTI+MgIG組與BLM組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；第14、28天時藥物干預各組大鼠肺纖維化程度均輕于BLM組，其中UTI+MgIG組與BLM組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of grades and scores of alveolitis and pulmonary fibrosis in five groups表1 各組大鼠肺泡炎和肺纖維化分級計分的比較（n=6，分）

Tab.1 Comparison of grades and scores of alveolitis and pulmonary fibrosis in five groups表1 各組大鼠肺泡炎和肺纖維化分級計分的比較（n=6，分）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與BLM組比較，P＜0.05

組別BLM組MTH組UTI組MgIG組UTI+MgIG組F肺泡炎第7天2.6±0.5 2.0±0.9 2.2±0.8 2.0±0.6 1.7±0.5a8.945＊＊第14天2.2±0.4 1.4±0.5 1.8±0.5 1.5±0.6 1.2±0.4a5.783＊第28天1.7±0.5 1.2±0.4 1.3±0.5 1.3±0.5 1.1±0.4 1.342肺纖維化第7天0.6±0.5 0.5±0.5 0.7±0.5 0.3±0.5 0.5±0.5 0.148第14天2.2±0.4 1.6±0.5 1.5±0.6 1.5±0.6 1.2±0.4a4.943＊第28天2.8±0.4 2.5±0.5 2.2±0.9 2.3±0.5 2.1±0.4a9.044＊＊

2.2 免疫組化結果

2.2.1 TGF-β1胞漿內有黃色或棕黃色的顆粒即為陽性表達部位。第7天時TGF-β1主要表達于肺泡巨噬細胞及少量成纖維細胞；第14天時支氣管、細支氣管黏膜上皮細胞及成纖維細胞TGF-β1表達明顯增強；第28天時TGF-β1在上述細胞漿內表達強度進一步增加。藥物干預組各時間點TGF-β1陽性表達強度較同期BLM組有所降低，見圖2。

TGF-β1表達水平比較：第7天時各用藥組均低于BLM組，UTI+MgIG組低于UTI組和MgIG組（P＜0.05）；第14天時MTH組、UTI組和UTI+MgIG組低于BLM組，UTI+MgIG組低于UTI組和MgIG組（P＜0.05）；第28天時MTH組、MgIG組和UTI+ MgIG組低于BLM組，UTI+MgIG組低于MTH組、UTI組和MgIG組（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of expression levels of TGF-β1 in lung tissue of five groups表2 不同時間各組大鼠肺組織TGF-β1表達水平比較（n=6，平均吸光度值，）

Tab.2 Comparison of expression levels of TGF-β1 in lung tissue of five groups表2 不同時間各組大鼠肺組織TGF-β1表達水平比較（n=6，平均吸光度值，）

＊＊P＜0.01；a與BLM組比較，b與MTH組比較，c與UTI組比較，d與MgIG組比較，P＜0.05；表3同

組別BLM組MTH組UTI組MgIG組UTI+MgIG組F第7天0.157±0.036 0.132±0.027a0.132±0.019a0.133±0.021a0.119±0.015acd16.597＊＊第14天0.228±0.067 0.173±0.075a0.174±0.057a0.194±0.047 0.133±0.032acd12.955＊＊第28天0.257±0.105 0.186±0.059a0.195±0.026 0.167±0.025ac0.143±0.027abcd20.837＊＊

2.2.2 CTGFCTGF陽性表達為棕黃色或褐色。第7天時主要表達于支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞和少量成纖維細胞；第14天時CTGF在成纖維細胞表達明顯增加，第28天時CTGF陽性表達進一步增強。藥物干預組各時間點CTGF表達強度均低于同期BLM組，見圖3。

CTGF表達水平比較：第7天時MTH組、UTI組和UTI+MgIG組低于BLM組，UTI+MgIG組低于UTI組和MgIG組（P＜0.05）；第14、28天時MTH組、MgIG組和UTI+MgIG組低于BLM組，UTI+MgIG組低于MTH組、UTI組和MgIG組（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of expression levels of CTGF in lung tissue of five groups表3 不同時間各組大鼠肺組織CTGF表達水平比較（n=6，平均吸光度值，）

Tab.3 Comparison of expression levels of CTGF in lung tissue of five groups表3 不同時間各組大鼠肺組織CTGF表達水平比較（n=6，平均吸光度值，）

組別BLM組MTH組UTI組MgIG組UTI+MgIG組F第7天0.385±0.094 0.298±0.091a0.316±0.079a0.321±0.077 0.263±0.057acd11.394＊＊第14天0.414±0.144 0.325±0.089a0.321±0.092 0.309±0.078a0.251±0.066abcd18.524＊＊第28天0.508±0.156 0.369±0.067a0.392±0.099 0.396±0.095a0.311±0.043abcd21.491＊＊

3 討論

IPF是一種病因及發病機制復雜的疾病，其主要病理學改變為肺泡炎及間質纖維化。本研究結果顯示，博萊霉素誘導的肺損傷初期以淋巴細胞、中性粒細胞等炎癥細胞浸潤為主，隨著時間推移，成纖維細胞增生逐漸增加，肺纖維化逐步加重。在此過程中，肺組織中的炎癥細胞和肺內細胞產生各種細胞因子及其他活性分子，激發成纖維細胞復制、增殖、合成過多膠原為主的細胞外基質（ECM）成分，導致大量膠原堆積［3］。因此，細胞因子是目前IPF的研究熱點。TGF-β是一種多功能的細胞因子，是肺纖維化發生過程中最直接作用的細胞因子［4］。實驗表明，TGF-β1在肺組織中可以刺激成纖維細胞增殖，同時也促進ECM的合成，另一方面抑制新合成的基質金屬蛋白酶（MMP）降解，還具有抑制肺泡上皮細胞增殖的作用［5］。CTGF作為TGF-β的下游因子，是一種新的可刺激成纖維細胞增殖和分泌膠原的生長因子，可能是肺纖維化發生過程中的一個關鍵調節因子［6］。本實驗中BLM組肺組織內TGF-β1和CTGF表達水平隨著時間推移逐漸升高，表明兩種因子與肺纖維化的發生、發展密切相關。

目前，肺纖維化尚無有效治療方案。治療藥物以皮質類固醇激素和免疫抑制劑合并應用為主［7-8］，但其臨床療效并不明顯，且長期使用不良反應較大，迫切需要新的治療藥物及方法。烏司他丁是人尿中分離純化的尿胰蛋白酶抑制劑，有研究表明其能明顯減輕百草枯中毒所致的大鼠肺泡炎及纖維化程度，抑制肺組織中TGF-β1過度表達［9］。異甘草酸鎂注射液是甘草酸的第4代新型制劑，有研究表明，MgIG連續治療能明顯降低百草枯染毒大鼠肺組織內的羥脯氨酸及血清細胞黏附分子-1（ICAM-1）、MMP-9，對百草枯中毒肺纖維化有一定的保護或治療作用［10］。本研究采用上述兩者聯合應用干預BLM致肺纖維化大鼠，結果顯示UTI聯合MgIG能明顯下調肺組織內TGF-β1和CTGF的表達，明顯減輕肺泡炎和肺纖維化程度，效果優于MTH組、UTI組及MgIG干組。因此，UTI聯合MgIG可用于臨床防治肺纖維化，并值得進一步研究。

（圖1～3見插頁）

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（2015-03-26收稿2015-04-17修回）

（本文編輯李國琪）

Effects of combination of ulinastatin and magnesium isoglycyrrhizinate on expression of TGF-β1 and CTGF in lung tissue of rats with pulmonary fibrosis

LIU Weiwei1，NIE Wei1，YUAN Ling1，ZHENG Hong2，CUI Xiaoxue1，SHEN Hongsheng1，LIU Dawei1
1 Tianjin Institute of Medical and Pharmaceutical Sciences，Tianjin 300020，China；2 Tianjin First Center Hospital

ObjectiveTo investigate the effects of ulinastatin（UTI）combined with magnesium isoglycyrrhizinate（MgIG）on the expression of transforming growth factor-β1（TGF-β1）and connective tissue growth factor（CTGF）in lung tis?sue of rats with pulmonary fibrosis induced by bleomycin（BLM）.MethodsNinety Wistar rats were randomly divided into five groups：BLM group，methylprednisolone（MTH）group，UTI group，MgIG group and UTI combined with MgIG（UTI+ MgIG）group，n=18 for each group.The rat model of pulmonary fibrosis was established by injecting bleomycin through tra?chea in five groups.Twenty-four hours after treatment with BLM，rats were treated with normal saline every day in BLM group，and rats were treated by corresponding drugs in other groups.Six rats of each group were killed at the 7th，14th and 28th day respectively.The pathological changes of alveolitis and pulmonary fibrosis were evaluated by HE staining，and ex?pression levels of TGF-β1 and CTGF in lung tissues were detected by immunohistochemistry method.Results（1）Com?pared with BLM group，the degree of alveolitis and pulmonary fibrosis was reduced in other groups.There was significant dif?ference in alveolitis at the 7th and 14th day between UTI+MgIG group and BLM group.And there was significant difference in pulmonary fibrosis at the 14th and 28th day between UTI+MgIG group and BLM group（P＜0.05）.（2）Compared with BLM group，the expression levels of TGF-β1 and CTGF were decreased in other groups.In UTI+MgIG group，the expres?sion levels of TGF-β1 were significantly lower at the 7th and 14th day compared with those in UTI group and MgIG group，and which were significantly lower at the 28th day than those in MTH group，UTI group and MgIG group（P＜0.05）.The ex?pression levels of CTGF were significantly lower at the 7th day in UTI+MgIG group than those in UTI group and MgIG group，and which were significantly lower at the 14th and 28th day than those in MTH group，UTI group and MgIG group（P＜0.05）.ConclusionThe combination of UTI and MgIG can alleviate alveolitis and fibrosis in BLM-induced pulmonaryfibrosis rats，which might related with the down-regulation of TGF-β1 and CTGF expressions.

pulmonary fibrosis；transforming growth factor beta1；rats，Wistar；connective tissue growth factor；ulinastatin；magnesium isoglycyrrhizinate

R563

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.09.007

天津市衛生局科技基金資助項目（2013KZ030）

1天津市醫藥科學研究所（郵編300020）；2天津市第一中心醫院

劉偉偉（1985），女，研究實習員，碩士，主要從事實驗病理研究