靶向腫瘤壞死因子β小分子抑制劑的篩選及其功能鑒定

孫亞薇，公海艷，曹善楠，劉鵬，朱海燕，耿廣鋒，許元富

細胞與分子生物學

靶向腫瘤壞死因子β小分子抑制劑的篩選及其功能鑒定

孫亞薇，公海艷，曹善楠，劉鵬，朱海燕，耿廣鋒，許元富△

目的通過計算機虛擬篩選和細胞活性篩選，獲得能靶向抑制腫瘤壞死因子β（TNFβ）的細胞毒活性的小分子抑制劑。方法根據TNFβ與腫瘤壞死因子Ⅰ型受體（TNFR1）結合的復合晶體結構，采用計算機虛擬篩選方法初步選擇對接結果較好的105個小分子化合物（C1～C105），并對其進行細胞活性篩選；MTT法檢測小分子化合物抑制TNFβ對L929細胞的細胞毒性；流式細胞術測定小分子化合物對TNFβ引起的細胞凋亡的抑制作用；采用碘化丙啶（PI）單染和流式分析技術檢測小分子化合物對L929細胞周期的影響；采用Western blot和雙轉盤激光共聚焦顯微鏡分析小分子化合物對TNFβ引起的下游Caspase 3活化的抑制作用。結果C35能有效抑制TNFβ引起的細胞毒作用，且這種抑制作用呈現劑量依賴性（半數抑制濃度=8.19 μmol/L）；C35具有較低的細胞毒性，且對L929細胞周期無影響；C35能阻斷TNFβ與其受體結合后引起的細胞凋亡通路，顯著抑制TNFβ引起的L929細胞凋亡。結論成功篩選到一個TNFβ小分子抑制劑C35，其能阻斷TNFβ引起的細胞凋亡通路，高效抑制TNFβ的細胞毒活性。

淋巴毒素α；受體，腫瘤壞死因子，Ⅰ型；細胞凋亡；細胞周期；腫瘤壞死因子β；小分子抑制劑；信號通路

腫瘤壞死因子（TNF）β，又名淋巴毒素α（lympho?toxin α，LTα），主要由激活的淋巴細胞分泌，能抑制惡性腫瘤細胞生長，與TNFα同屬腫瘤壞死因子超家族［1］。TNF家族成員中被研究的較為廣泛和深入的是TNFα，研究發現TNFα與類風濕性關節炎、強直性脊柱炎、炎癥性腸炎、銀屑病、多發性硬化、急性肝炎等疾病的發生具有重要關系［2-3］；而關于TNFβ的研究較少，近年來研究發現TNFβ與許多疾病的發生發展具有重要的相關性，如移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）、類風濕性關節炎、高血鈣癥等［4］。目前市場上尚無針對TNFβ開發的特異性藥物，只有極個別針對TNFα的大分子受體樣藥物可同時抑制TNFα和TNFβ的細胞毒性，如Etanercep（t伊納西普）［4］。雖然大分子藥物具有一些獨特的優勢，如靶向性強、半衰期長、臨床療效明顯，但其也有一些難以克服的缺陷，如穩定性差、生產和治療成本高、難以透過血腦屏障、不能口服使用、長期應用會導致中和性抗體的產生和藥物的耐受等。因此，研制特異性抑制TNFβ的小分子抑制劑尤為重要。本研究基于TNFβ與腫瘤壞死因子Ⅰ型受體（TNFR1）結合的復合晶體結構，采用計算機虛擬篩選結合細胞活性篩選的方法，從已有的含有9萬個小分子的化合物數據庫中，篩選靶向TNFβ的特異性小分子抑制劑，以期為基礎和臨床研究TNFβ相關疾病提供實踐經驗和靶向藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑RPMI-1640培養基干粉及胎牛血清（FBS）購自GIBCO公司；TNF β（1 μg/L）、TNF βAntibody（1 mg/L）購于Peprotech公司，放線菌素D（ActD，1 mg/L）、MTT、DMSO購于Sigma公司（CA，US）；胰酶購自Hyclone公司；C35及其他小分子化合物購于Specs公司，純度均大于99%。Annexinⅴ-PI細胞凋亡試劑盒和周期檢測試劑盒購自BD公司；抗Caspase 8、Caspase 3、cleaved caspase 8、cleaved caspase 3、GAPDH的兔源一抗購自Cell Signal Tech?nology公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗購自北京中山金橋生物技術有限公司；ECL免疫印跡底物、BCA蛋白定量試劑盒購自Pierce公司；PVDF膜購自Millipore公司；RIPA裂解液（中）、PMSF、柯達底片購自碧云天生物技術研究所。

1.1.2 主要儀器CO2孵箱購自美國Thermo Fisher公司；倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；流式細胞儀（LSRⅡ）購自BD公司；蛋白電泳儀以及轉膜儀購自美國BIO-RAD公司；雙轉盤激光掃描共聚焦顯微鏡購自德國Leica公司。

1.1.3 細胞株小鼠的成纖維細胞株L929由本實驗室保存。取對數生長期的L929細胞用于實驗。

1.2 方法

1.2.1 C1～C105號小分子抑制劑的細胞活性篩選采用計算機虛擬篩選方法對含有約9萬個小分子的三維數據庫進行分子對接篩選，選擇對接結果較好的105個小分子化合物進行生物活性篩選實驗。取L929細胞以1×104個/孔細胞接種于96孔板中，于37℃5%CO2培養箱中培養24 h后，加入終濃度1 mg/L的ActD及1 μg/L的TNFβ，同時分別加入C1～C105號小分子化合物，均設0.4、4、20 μmol/L 3個濃度梯度。置于細胞培養箱中培養。20 h后取出，每孔加入20 μL MTT，繼續培養4 h，棄上清，每孔加150 μL DMSO，充分溶解后在酶標儀測每孔光密度（OD）546的讀數。計算細胞存活率=（ODActD+TNFβ+compound-ODblank）/（ODActD-ODblank）×100%。

1.2.2 MTT法檢測C35對TNFβ介導的細胞毒作用取L929細胞以1×104個/孔細胞接種于96孔板中，于37℃5% CO2培養箱中培養24 h。將C35號小分子化合物與1 mg/L的ActD及1 μg/L的TNFβ室溫共孵育30 min后加入其中，分別設C35號化合物的終濃度為100、25、6.4、1.6、0.4及0.1 μmol/ L，每個濃度設3個復孔。按1.2.1操作計算細胞存活率，并用Graghpad Prism5軟件計算C35的半數抑制濃度（IC50）。

1.2.3 C35對TNFβ介導的細胞凋亡的抑制實驗取L929細胞以1×106個/皿細胞接種于5個10 cm細胞培養皿中，于37℃5%CO2培養箱中培養24 h后加入不同藥物組合，繼續培養12 h后取出，倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態。實驗設Control組（ActD）、TNFβ組（ActD+TNFβ）、TNFβ+A8組（陰性化合物對照組，ActD+TNFβ+A8）、TNFβ+C35組（ActD+TNFβ+ C35）、TNFβ+Antibody組（陽性對照組，ActD+TNFβ+anti-TNFβ Antibody）。收集各皿細胞制成單細胞懸液，按照BD公司Annexinⅴ-PI細胞凋亡試劑盒對各組細胞進行標記，后經濾網過濾后流式細胞儀測定各組細胞發生凋亡的百分數。

1.2.4 C35對L929細胞周期的影響采用碘化丙啶（PI）單染和流式分析技術檢測小分子化合物對L929細胞周期的影響。取L929細胞以1×106個/皿細胞接種于5個10 cm細胞培養皿中，于37℃5%CO2培養箱中培養24 h后加入不同藥物組合。實驗設Blank組（不加任何藥物處理）、ActD組、C35組、ActD+C35組、ActD+C35+TNFβ組。按照BD公司細胞周期檢測試劑盒說明書測定各組細胞周期，用尼龍網過濾樣品，流式細胞儀測定各組細胞的細胞周期。

1.2.5 C35對TNFβ下游Caspase 3活化的抑制實驗（1）Western blot法。細胞接種培養和分組操作同1.2.3。細胞繼續孵育2、8、12 h時收集細胞，RIPA裂解，離心后收集上清液，BCA法測定各組蛋白濃度，Western blot法分析各組蛋白表達情況。（2）免疫熒光法。取L929細胞以1×105個/皿細胞接種于共聚焦小皿中，分組操作同1.2.3。參照文獻［5］的方法進行免疫熒光染色，置于雙轉盤激光共聚焦顯微鏡上檢測。

1.3 統計學方法采用SPSS 17.0軟件包進行數據分析，數據采用表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 C1～C105號小分子抑制劑的細胞活性篩選結果C35化合物在20 μmol/L時對TNFβ有較好的抑制效果，細胞存活率可達90%以上，C27和C36在20 μmol/L時也有一定的抑制效果，細胞存活率分別為38.5%±2.38%和59.1%±8.24%，其余對TNFβ細胞毒性的抑制效果不明顯或無抑制效果，見圖1。

Fig.1 Biological activity screening for TNFβ small-molecule inhibitor圖1 TNFβ小分子抑制劑的細胞活性篩選

2.2 C35對TNFβ介導的細胞毒作用的抑制實驗結果C35濃度為0.1、0.4、1.6、6.4、25和100 μmol/L時，細胞存活率分別為（19.80±5.37）%、（19.18± 6.68）%、（24.74±0.23）%、（32.12±4.26）%、（97.74± 10.13）%和（95.73±4.42）%。由此可見，C35對TNFβ細胞毒性的抑制作用呈現劑量依賴性，且在100 μmol/L時未見C35自身的細胞毒性。IC50為8.19 μmol/L。

2.3 C35對TNFβ介導的細胞凋亡的抑制實驗結果光鏡下可見Control組細胞生長狀態良好，多數細胞為梭形或三角形，邊緣清晰；而TNFβ組和TNFβ+A8組細胞多數死亡，鏡下可見很多細胞碎片；TNFβ+C35組和TNFβ+Antibody組細胞生長較好，細胞形態接近Control組，見圖2。TNFβ+C35、TNFβ+Antibody組細胞存活率（92.03%±4.80%、91.10%±6.76%）均高于TNFβ組（27.57%±3.92%）和TNFβ+A8組（32.97%±9.05%），與Control組（94.33%±2.61%）差異無統計學意義；TNFβ+C35組與TNFβ+Antibody組、TNFβ+A8與TNFβ組間差異均無統計學意義（F=101.931，P＜0.01），見圖3。

2.4 C35對細胞周期的影響各組間L929細胞周期分布差異無統計學意義，見表1。

2.5 Western Blot檢測結果與Control組相比，TNFβ刺激L929細胞8 h和12 h后，TNFβ組和TNFβ+A8組中均出現切割活化的Caspase 3片段，而TNFβ+C35組和TNFβ+Antibody組Caspase 3未出現切割活化，見圖4。

2.6 免疫熒光檢測結果Control組細胞輪廓清晰，狀態良好，細胞骨架完整；與Control組相比，TNFβ刺激L929細胞8 h后，TNFβ組和TNFβ+A8組出現切割活化的Caspase 3蛋白，且細胞骨架被破壞；而TNFβ+C35組和TNFβ+Antibody組細胞狀態良好，并未出現活化的Caspase 3蛋白，見圖5。

Tab.1 Comparison of the L929 cell cycle distributions after different treatments between five groups表1 不同藥物組處理后L929細胞周期分布的比較（n=3，%，）

Tab.1 Comparison of the L929 cell cycle distributions after different treatments between five groups表1 不同藥物組處理后L929細胞周期分布的比較（n=3，%，）

均P＞0.05

組別Blank組ActD組C35組ActD+C35組ActD+C35+TNFβ組F G0/G1期46.03±1.48 48.20±4.52 41.26±1.40 44.10±2.37 45.84±2.57 2.729 S期39.38±0.39 35.81±3.01 38.73±1.12 39.35±1.13 36.69±3.45 1.704 G2期14.23±1.37 15.96±1.61 19.58±1.87 16.48±1.28 17.46±0.99 3.125

Fig.4 Western blot analysis of inhibitory effect of C35 on TNFβinduced activation of Caspase 3圖4 C35抑制TNFβ介導的下游Caspase 3活化的Western blot檢測結果

3 討論

TNFβ主要是由激活的T和B淋巴細胞分泌的細胞因子，與TNFα具有相同的受體，即TNFR1和TNFR2，TNFα和TNFβ與受體結合后均能引起細胞凋亡、壞死及其下游炎癥信號通路的活化［6］。近年來研究發現TNFβ參與類風濕關節炎和GVHD等多種疾病的發生發展，并且有報道采用TNFβ的單克隆抗體治療二型膠原誘導的小鼠關節炎療效顯著［7］。Markey等［8］研究發現將TNFβ敲除的B6鼠的骨髓移植到BALB/c小鼠體內后發生GVHD的概率大大降低，提示供者來源細胞產生的TNFβ是GVHD發生的重要原因之一。目前，已有針對TNF受體下游信號通路中某些分子的小分子抑制劑的研究，如P38抑制劑、JNK抑制劑（tofacitinib）等［9］，但其特異性較差，不良反應較大，而解決上述問題的可行方案之一就是研制直接靶向結合TNFβ的小分子抑制劑。

本研究根據已經獲得的TNFβ與TNFR1結合的復合晶體結構，選擇受體TNFR1蛋白第二結構域第二環中的一個七肽片段（RKEMGQV）作為分子對接（docking）的模板［10-11］，采用計算機虛擬篩選方法對含有約9萬個小分子的三維數據庫進行分子對接篩選，選擇對接結果較好的105個化合物進行初步的抑制TNFβ細胞毒活性的實驗。結果表明，C35能較好地抑制TNFβ的細胞毒作用，并呈現劑量依賴性。流式細胞術分析顯示，TNFβ+C35組細胞存活率明顯高于TNFβ組，提示C35能夠有效抑制TNFβ介導的L929細胞的凋亡。細胞周期實驗結果顯示，無論是單加C35還是與其他藥物一起加入，其對L929細胞G1、S、G2期的影響均不明顯，提示C35并不是通過促進細胞增殖來提高細胞存活率的。

TNFβ與TNFR結合后，可以激活促凋亡相關信號級聯反應，最終引起下游Caspase 3的活化，導致細胞凋亡的發生［5］。本研究結果顯示，TNFβ刺激L929細胞8 h后，TNFβ組和TNFβ+A8組Caspase 3出現切割活化，而TNFβ+C35組和TNFβ+Antibody組Caspase 3未活化，提示C35與TNFβ抗體均可有效地抑制TNFβ下游Caspase 3的切割活化。考慮到Western Blot檢測的是細胞群體某一蛋白表達量的變化，并不能直觀地反映到每個細胞的變化水平，因此本研究又采用共聚焦顯微鏡結合細胞免疫染色的方法，進一步從單細胞水平驗證C35對TNFβ信號通路的抑制作用。結果顯示，TNFβ刺激L929細胞8 h后，TNFβ組和TNFβ+A8組出現活化的Cas?pase 3蛋白片段，且完整的細胞骨架被破壞；而TNFβ+C35組和TNFβ+Antibody組細胞狀態均良好，并未見活化的Caspase 3蛋白，提示C35可以在單細胞水平上較好地抑制TNFβ介導的下游Cas?pase 3的切割活化。

綜上所述，本研究用計算機虛擬篩選結合細胞活性篩選得到的小分子化合物C35能與TNFβ靶向結合，較好地抑制TNFβ介導的細胞毒作用，同時有效阻斷TNFβ下游級聯信號通路的活化。C35模擬TNFR1蛋白第二結構域的第二Loop環的一個七肽片段（RKEMGQV，No.77-83），以此作為分子對接的模板，與TNFβ直接結合，具有高度特異性和原始創新性。目前本課題組正在進一步進行相關的體內試驗，有望為今后靶向TNFβ的小分子抑制劑的研究提供理論基礎和實踐經驗，為臨床相關疾病的治療提供新思路。

（圖2、3、5見插頁）

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（2015-02-11收稿2015-04-14修回）

（本文編輯陳麗潔）

Screening and identification of a novel small-molecule TNFβ inhibitor

SUN Yawei，GONG Haiyan，CAO Shannan，LIU Peng，ZHU Haiyan，GENG Guangfeng，XU Yuanfu△
State Key Laboratory of Experimental Hematology，Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Tianjin 300020，China△

ObjectiveTo explore a novel and highly specific small-molecule TNFβ inhibitor by using computer-aid?ed virtual screening and cell-based assays in vitro.MethodsComputer-aided drug design and virtual screening were used to design and identify chemical compounds that targeted TNFβ based on the crystal structure of the TNFβ-TNFR1 com?plex.The effect of the small-molecule compound against TNFβ-induced cytotoxicity of L929 cells was detected by MTT as?say，and the efficacy of the compound to inhibit TNFβ-induced apoptosis of L929 cells was determined by flow cytometry as?say.The impact of the compound on L929 cell cycle was examined by Propidium Iodide（PI）staining and flow cytometry，and the influence of the compound on TNFβ-triggered signal pathway was analyzed by Western blot assay and Ultra VIEW VOX 3D Live Cell Imaging System.ResultsNo.35 compound（named as C35 thereafter）could effectively inhibit TNFβ-induced cell death in a dose dependent manner，and the half-maximum inhibition concentration（IC50）was 8.19 μmol/L.Furthermore，C35 had lower cytotoxicity and minimal effect on L929 proliferation.Here we further revealed that C35 could affect TNFβinduced apoptotic pathway by blocking the activation of Caspase 3，and markedly reduce L929 cell apoptosis induced by TNFβ.ConclusionA novel TNFβ small-molecule inhibitor was identified by combining computer-aided virtual screening with functional assays，and which could block TNFβ-triggered apoptotic pathway and efficiently inhibit the cell death in?duced by TNFβ.

lymphotoxin-alpha；receptors，tumor necrosis factor，type I；apoptosis；cell cycle；TNFβ；small molecular inhibitor；signal pathway

R730.231；R730.1

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.09.001

國家自然科學基金資助項目（31271484，31471116）；天津市自然科學基金重點基金（12JCZDJC24600）；北京協和醫學院研究生創新基金（100023-0710-1013）

中國醫學科學院，北京協和醫學院血液病醫院（血液學研究所），實驗血液學國家重點實驗室（郵編300020）

孫亞薇（1988），女，碩士在讀，主要從事腫瘤壞死因子的小分子抑制劑的研究

△通訊作者E-mail：xuyf@ihcams.ac.cn