3份胡椒屬種質(zhì)花粉離體萌發(fā)研究①

伍寶朵++郝朝運(yùn)+胡麗松++范睿++鄔華松

摘 要 以海南蒟、大葉蒟和球穗胡椒的花粉為材料，研究了不同培養(yǎng)基和采樣時(shí)間對(duì)花粉萌發(fā)率的影響。結(jié)果表明：3種胡椒種質(zhì)花粉的最佳萌發(fā)條件分別為100 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸+600 mg/L Ca（NO3）2、100 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸+300 mg/L Ca（NO3）2和100 g/L蔗糖+200 mg/L硼酸+300 mg/L Ca（NO3）2。ME3培養(yǎng)基抑制海南蒟和球穗胡椒花粉萌發(fā)，蔗糖、硼酸和Ca2+的協(xié)同作用可以提高胡椒花粉萌發(fā)率，硼酸的濃度需要控制在一定范圍內(nèi)（≤200mg/L），300～600 mg/L的Ca2+濃度對(duì)花粉萌發(fā)率影響不顯著。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，9：00～10：00或16：30是收集這3種胡椒種質(zhì)花粉進(jìn)行雜交試驗(yàn)的較佳時(shí)間。

關(guān)鍵詞 胡椒屬 ；花粉；離體萌發(fā) ；遠(yuǎn)源雜交

分類號(hào) S339.3+2

胡椒（Piper nigrum L.）是胡椒科（Piperaceae）胡椒屬（Piper）多年生常綠藤本植物，是世界重要的熱帶香辛料作物[1-2]。在醫(yī)學(xué)工業(yè)中胡椒被用作健胃劑、解熱劑和支氣管粘膜刺激劑等；食品工業(yè)被用作抗氧化劑、防腐劑和保鮮劑等[3]。中國胡椒主要分布在海南、云南、廣東、廣西和福建等省（區(qū)），種植面積超過3萬hm2，年產(chǎn)約2.7萬t，均居世界第五，其中海南是胡椒主產(chǎn)區(qū)，種植面積和產(chǎn)量均占全國90%以上[4]。

胡椒原產(chǎn)印度西高止山脈，經(jīng)歷了2000多年的馴化，目前廣泛種植于中國、印度、越南、柬埔寨、巴西等40多個(gè)國家，其中以印度的栽培品種最多[5]。胡椒育種的目標(biāo)除高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和適應(yīng)性良好外，還要針對(duì)危害胡椒生產(chǎn)的首要病害（胡椒瘟病）進(jìn)行。但有關(guān)胡椒育種方面的資料有限，近年除印度、中國、馬來西亞外，其它胡椒主產(chǎn)國很少有相關(guān)報(bào)道[5]。中國至今引種并培育了一批胡椒栽培種質(zhì)，如云選1號(hào)、班尼約爾1號(hào)、柬埔寨小葉種、73-F-5、柬×印23等，總體來說，中國胡椒品種相對(duì)較少[6-7]，導(dǎo)致胡椒栽培品種遺傳背景比較狹窄，對(duì)開展胡椒育種工作不利。胡椒野生種葉間距、葉片、花序和果實(shí)大小等存在很大的表型變異[7]，且野生種質(zhì)中具有抗病等多種優(yōu)異基因資源，通過遠(yuǎn)源雜交合理利用野生種質(zhì)優(yōu)異基因資源進(jìn)行胡椒雜交育種，是增加變異的有效手段。

花粉是種子植物的雄性配子體，在有性繁殖中扮演著重要角色。明確胡椒野生種質(zhì)花粉萌發(fā)條件對(duì)指導(dǎo)胡椒遠(yuǎn)緣雜交育種具有重要理論和現(xiàn)實(shí)意義。目前，僅Shang等[8]對(duì)巴西野生種哥魯波利胡椒的花粉萌發(fā)進(jìn)行了初步研究，其他還未見報(bào)道。海南蒟產(chǎn)于廣東南部、海南及廣西南部至西南部；全株可入藥，花穗長且密集；大葉蒟是中國的特有植物，分布于廣東、海南等地的樹上、密林中或石上，花單性，雌雄異株，具有果穗較長的特點(diǎn)；球穗胡椒是纖細(xì)攀援藤本，生于亞熱帶山谷密林或疏林中、攀援于樹上，花穗密集。本研究對(duì)海南蒟、大葉蒟和球穗胡椒3種野生胡椒種質(zhì)的花粉萌發(fā)培養(yǎng)基培養(yǎng)體系和采樣時(shí)間進(jìn)行了研究，探討了影響胡椒花粉萌發(fā)的因素，為胡椒遠(yuǎn)源雜交工作的開展提供參考，以促進(jìn)我國胡椒產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為海南蒟（Piper hainanense）、大葉蒟（Piper laetispicum）、球穗胡椒（Piper thomsonii），均來自于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所內(nèi)的農(nóng)業(yè)部萬寧胡椒種質(zhì)資源圃。

1.2 方法

以雄花開放一半以上的花穗為研究對(duì)象，用于萌發(fā)條件摸索的花粉于晴天9：00采集，并用無菌水反復(fù)沖洗，收集沖洗液。將培養(yǎng)基和花粉收集液滴加到帶凹槽的載玻片上，28℃培養(yǎng)5 h，花粉離體萌發(fā)以花粉管長于花粉直徑為標(biāo)準(zhǔn)。在Olympus（BX51）顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，每次每個(gè)處理分別取3個(gè)固定大小的視野統(tǒng)計(jì)，單次統(tǒng)計(jì)花粉數(shù)不少于60個(gè)，萌發(fā)率（%）=（萌發(fā)花粉總數(shù)/總花粉數(shù)）×100。

1.2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)花粉萌發(fā)率的影響

在不同濃度蔗糖（50、100、200 g/L）的基礎(chǔ)上，比較1/2 ME3、ME3[9]的作用，以蔗糖培養(yǎng)基為對(duì)照。在不同濃度蔗糖（50、100、200 g/L）的基礎(chǔ)上，分別添加100、200、300 mg/L H3BO3，以及300、600 mg/L Ca（NO3）2，分析硼酸和Ca2+濃度增加對(duì)花粉萌發(fā)的影響。對(duì)3種胡椒屬種質(zhì)進(jìn)行花粉離體培養(yǎng)，調(diào)查花粉離體萌發(fā)率，選取較優(yōu)培養(yǎng)基組合。

1.2.2 不同取樣時(shí)間對(duì)花粉萌發(fā)率的影響

依據(jù)試驗(yàn)選取最佳培養(yǎng)基，對(duì)不同取樣時(shí)間花粉進(jìn)行離體培養(yǎng)。在3種胡椒屬種質(zhì)盛花期分別于8：00，10：00，14：30，16：30收集花粉進(jìn)行離體培養(yǎng)，觀察各種胡椒不同取樣時(shí)間花粉萌發(fā)情況并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，重復(fù)3次。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用spss軟件進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對(duì)花粉萌發(fā)率的影響

分別以50、100、200 g/L蔗糖培養(yǎng)基離體培養(yǎng)3種胡椒種質(zhì)花粉，都有一定的萌發(fā)，萌發(fā)率介于2.23%～14.54%（表1）。在50 g/L蔗糖培養(yǎng)基中，大葉蒟、海南蒟和球穗胡椒花粉萌發(fā)率分別為2.23%、14.54%和6.82%；在100g/L蔗糖培養(yǎng)基中，3種胡椒種質(zhì)花粉萌發(fā)率分別為1.94%、9.39%和9.50%；而在200 g/L蔗糖培養(yǎng)基中，大葉蒟和海南蒟花粉萌發(fā)受到抑制，萌發(fā)率低于1%，球穗胡椒花粉有一定的萌發(fā)（6.51%）。其中以海南蒟在50 g/L蔗糖培養(yǎng)基中萌發(fā)率最高。在蔗糖基礎(chǔ)上添加ME3的研究表明，蔗糖和1/2 ME3、ME3互作條件下，只有大葉蒟有一定萌發(fā)，且在50 g/L蔗糖+1/2 ME3培養(yǎng)基中萌發(fā)率較高（19.58%），海南蒟和球穗胡椒花粉在蔗糖培養(yǎng)基添加1/2 ME3、ME3基本培養(yǎng)基中沒有萌發(fā)，萌發(fā)率低于1%。

設(shè)置蔗糖+100 mg/L H3BO3+300 mg/L Ca（NO3）2和蔗糖+100 mg/L H3BO3+600 mg/L Ca（NO3）2進(jìn)行Ca2+濃度對(duì)胡椒花粉萌發(fā)影響的研究（表2）。在50 g/L蔗糖+100 mg/L H3BO3培養(yǎng)基中，將Ca（NO3）2濃度由300 mg/L提高至600 mg/L時(shí)，大葉蒟花粉萌發(fā)率變化不大，海南蒟花粉萌發(fā)率則由28.47%增加至47.70%，球穗胡椒花粉萌發(fā)率由41.26%降低至27.88%。在100 g/L蔗糖+100 mg/L H3BO3培養(yǎng)基中，隨Ca（NO3）2濃度提高，大葉蒟花粉萌發(fā)率由47.22%增加至65.15%，海南蒟花粉萌發(fā)率由62.20%降低至46.66%，球穗胡椒花粉萌發(fā)率由31.60%降低至20.44%。在200 g/L蔗糖+100 mg/L H3BO3培養(yǎng)基中，隨Ca（NO3）2濃度提高，大葉蒟花粉萌發(fā)率由17.97%增加至21.12%，海南蒟花粉萌發(fā)率由43.40%降低至33.35%，球穗胡椒花粉萌發(fā)率由16.71%降低至13.32%。總體而言，Ca2+濃度由300 mg/L增加至600 mg/L時(shí)，3種胡椒花粉萌發(fā)率沒有顯著性變化；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，添加了硼酸和Ca2+的蔗糖培養(yǎng)基比單一的蔗糖培養(yǎng)更能促進(jìn)胡椒花粉的萌發(fā)。說明在蔗糖培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，硼酸和Ca2+的協(xié)同作用可以顯著提高胡椒花粉萌發(fā)率，但是在一定濃度條件下（300～600 mg/L），改變Ca2+濃度對(duì)花粉的萌發(fā)率沒有顯著影響。

以蔗糖+100 mg/L H3BO3+300 mg/L Ca（NO3）2為對(duì)照，研究增加硼酸濃度對(duì)胡椒花粉萌發(fā)影響（表3）。結(jié)果表明，在50 g/L蔗糖+300 mg/L Ca（NO3）2培養(yǎng)基中，隨硼酸濃度的提高，大葉蒟花粉萌發(fā)率由39.23%降低至13.96%；海南蒟花粉萌發(fā)率由28.47%提高至32.42%，又降低至16.69%；球穗胡椒花粉萌發(fā)率由41.26%提高至48.11%，又降低至25.80%；表明在該培養(yǎng)基中，硼酸濃度由100 mg/L增加至300 mg/L時(shí)，3種胡椒花粉萌發(fā)率顯著降低。在100 g/L蔗糖+300 mg/L Ca（NO3）2培養(yǎng)基中，隨硼酸濃度的提高，大葉蒟花粉萌發(fā)率由47.22%降低至1.19%；海南蒟花粉萌發(fā)率由62.20%降低至22.95%；球穗胡椒花粉萌發(fā)率由31.60%提高至55.12%，又降低至20.69%；結(jié)果同樣表明，在該培養(yǎng)基中，隨硼酸濃度增加，3種胡椒花粉萌發(fā)率顯著降低。在200 g/L蔗糖+300 mg/L Ca（NO3）2培養(yǎng)基中，隨硼酸濃度的提高，大葉蒟花粉萌發(fā)率由17.97%增加至32.85%，又降低至18.70%；海南蒟花粉萌發(fā)率由43.40%降低至28.69%，又提高至31.47%；球穗胡椒花粉萌發(fā)率由16.71%提高至24.99%，又降低至18.16%；表明在該培養(yǎng)基中，硼酸濃度由100 mg/L增加至300 mg/L時(shí)，海南蒟和球穗胡椒花粉萌發(fā)率沒有顯著性變化，而大葉蒟花粉萌發(fā)率在200 mg/L硼酸濃度比對(duì)照和300 mg/L硼酸濃度時(shí)有顯著提高。

2.2 取樣時(shí)間對(duì)花粉萌發(fā)率的影響

3種胡椒種質(zhì)花粉及萌發(fā)情況如圖1所示，花粉粒在萌發(fā)前、后都是圓形，花粉形態(tài)與哥魯波利胡椒不同[8]。在10：00和14：30收集的3種胡椒種質(zhì)花粉萌發(fā)率不高（圖2）；大葉蒟和球穗胡椒在10：00以前和16：30收集的花粉萌發(fā)率顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)，而海南蒟花粉在10：00以前萌發(fā)率較高，10：00之后萌發(fā)率不高。從3種胡椒種質(zhì)在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集平均花粉數(shù)量來看，上午8：00收集花粉量最少，其他時(shí)間收集花粉量偏多。

3 討論

蔗糖、硼酸和鈣是花粉萌發(fā)和花粉管伸長的必需物質(zhì)，也是花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基的主要成分[10]。ME3基本培養(yǎng)基中含有多種礦質(zhì)元素，在花粉管形成過程中起重要作用[11-12]。因此本研究選用了蔗糖、硼酸、Ca（NO3）2和ME3培養(yǎng)基作為胡椒花粉離體萌發(fā)的培養(yǎng)基組成，首次明確了3種胡椒種質(zhì)（大葉蒟、海南蒟和球穗胡椒）花粉最佳萌發(fā)條件分別為100 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸+600 mg/L Ca（NO3）2、100 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸+300 mg/L Ca（NO3）2和100 g/L蔗糖+200 mg/L硼酸+300 mg/L Ca（NO3）2。在花粉離體萌發(fā)中蔗糖的作用是提供滲透壓和花粉管形成需要的能量，3種胡椒種質(zhì)花粉在蔗糖培養(yǎng)基中都能萌發(fā)，但是萌發(fā)率不高。ME3培養(yǎng)基含有多種礦質(zhì)元素，可以促進(jìn)花粉管的萌發(fā)[13]。本研究中大葉蒟花粉在添加了ME3的蔗糖培養(yǎng)基中萌發(fā)率有一定提高，但海南蒟和球穗胡椒花粉萌發(fā)被抑制，萌發(fā)率小于1%，原因可能是在ME3培養(yǎng)基中含有礦質(zhì)元素的濃度抑制了海南蒟和球穗胡椒花粉萌發(fā)，該結(jié)論有待實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步證明。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ME3培養(yǎng)基不適合用于大葉蒟、海南蒟和球穗胡椒花粉離體萌發(fā)。

Ca2+可通過多種途徑影響花粉萌發(fā)和花粉管生長[14]。硼可以參與花粉管頂端細(xì)胞壁的形成，促進(jìn)花粉萌發(fā)和花粉管生長[15]。本研究也證明，蔗糖培養(yǎng)基中添加硼酸和Ca（NO3）2使胡椒花粉萌發(fā)率顯著提高，因此蔗糖、硼酸和Ca（NO3）2的協(xié)同作用可以提高胡椒花粉萌發(fā)率。通過硼酸濃度實(shí)驗(yàn)表明，在胡椒花粉萌發(fā)中硼酸的濃度需要控制在一定范圍內(nèi)（≤200 mg/L），當(dāng)硼酸濃度過高時(shí)對(duì)3種胡椒花粉萌發(fā)都會(huì)起抑制作用。在50 g/L蔗糖+300 mg/L Ca（NO3）2和100 g/L蔗糖+300 mg/L Ca（NO3）2培養(yǎng)基中，當(dāng)硼酸濃度達(dá)到300 mg/L時(shí)，3種胡椒花粉萌發(fā)率都顯著降低，說明含有50 g/L蔗糖和100 g/L蔗糖的培養(yǎng)基中，硼酸濃度過高（≥200 mg/L）對(duì)胡椒花粉萌發(fā)不利；在200 g/L蔗糖+300 mg/L Ca（NO3）2培養(yǎng)基中，隨硼酸濃度的變化，海南蒟和球穗胡椒的花粉萌發(fā)沒有顯著性變化，表明蔗糖濃度達(dá)到200 g/L時(shí)，硼酸的濃度對(duì)海南蒟和球穗胡椒的花粉萌發(fā)沒有影響。本研究發(fā)現(xiàn)，在蔗糖+100 mg/L硼酸培養(yǎng)基中，將Ca（NO3）2濃度由300 mg/L 增加至600 mg/L時(shí)，Ca2+濃度改變對(duì)花粉的萌發(fā)率沒有顯著影響。

Shang等[8]通過對(duì)巴西野生種哥魯波利胡椒的觀察，發(fā)現(xiàn)該種質(zhì)花粉在9：00散粉，散粉2～8 h內(nèi)萌發(fā)率較高。本研究為利于田間操作，以采集雄花開放一半以上的花穗為對(duì)象，分5個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，研究顯示在10：00和14：30收集的胡椒花粉萌發(fā)率不高。10：00以前和16：30花粉萌發(fā)率偏高，但是上午8：00收集花粉量最少。因此選擇本研究中3種胡椒作為父本進(jìn)行雜交試驗(yàn)在9：00～10：00或16：30以后，花粉萌發(fā)效果較好。印度班尼約爾研究站在花粉剛剛散粉（傍晚）后進(jìn)行胡椒栽培品種雜交試驗(yàn)，與Shang等[8]研究結(jié)果不同，原因可能是試驗(yàn)選用的種質(zhì)不同，不同國家的氣候差異所致。

參考文獻(xiàn)

[1] 童漢清，吳景雄，李 田，等. 胡椒油的抗氧化性研究[J]. 中國調(diào)味品，2008（10）：52-55.

[2] 徐 燕，劉德清. 胡椒中天然防腐劑的提取方法及其抑菌作用研究[J]. 中國調(diào)味品，2007（7）：57-60.

[3] Tripathi A K，Jain D C，Sushil K. Secondary metabolites and their biological and medical activities of Piper species plants[J]. Journal of Medicinal and Aromatic Plant Sciences，1996，18：302-321.

[4] 楊建峰，鄔華松，孫 燕，等. 我國胡椒產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展對(duì)策[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，30（3）：1-4.

[5] 劉進(jìn)平，鄭成木. 胡椒育種的理論與實(shí)踐[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科技，2003，26（1）：32-37.

[6] 劉進(jìn)平，鄔華松，楊建峰. 國內(nèi)外胡椒品種述評(píng)[J]. 中國熱帶農(nóng)業(yè)，2009，1：49-52.

[7] 鄭維全. 海南胡椒雜交種質(zhì)主要農(nóng)藝性狀觀測(cè)[J]. 廣西熱帶農(nóng)業(yè)，2006，105（4）：33-34.

[8] Shang C Y， Tawan C S， Det P A， et al. A Study on Pollen Viability of Piper colubrinum Link[J]. Journal of Agricultural Science and Technology B 2， 2012： 1 177-1 183.

[9] Leduc N， Monnier M， Douglas G C. Germination of trinucleated pollen：formulation of a new medium for Capsella bursa-pastoris[J]. Sexual Plant Reproduction， 1990， 3（4）： 228-235.

[10] 潘瑞熾. 植物生理學(xué)[M]. 北京：高等教育出版社，2001，260.

[11] 唐 岱，李明揚(yáng). 菊花花粉萌發(fā)及花粉活力研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1993，15（4）：359-362.

[12] 邢艷萍，張 建，吳 杰，等. 東北地區(qū)5種蒲公英花粉離體萌發(fā)條件及特性的研究[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，43（3）：295-299.

[13] 呂晉慧，趙 耀，任 意，等. 地被菊花粉生活力測(cè)定及影響因素研究[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2011，26（4）：189-193.

[14] 胡適宜，楊弘遠(yuǎn). 被子植物受精生物學(xué)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2002：29-58.

[15] 胡適宜. 被子植物胚胎學(xué)[M]. 北京：高等教育出版社，1982：103-136.