高大山羊草1Sl染色體特異分子標記的建立與應用

劉曉明+張姝倩+宮文英+等

摘要：導入小麥的高大山羊草（Aegilops longissima）1S1染色體可以顯著提高小麥加工品質及子粒Fe和Zn元素含量，因此，1Sl染色體特異分子標記的建立對子粒Fe和Zn元素含量高的高品質小麥的選育具有重要意義。試驗建立了高大山羊草1S1染色體特異分子標記9個，其中染色體短臂標記2個，長臂標記6個，同時定位于長臂和短臂的標記1個。利用建立的分子標記對雜交群體進行檢測，結果表明，建立的9個標記可以對分離群體進行有效篩選與鑒定。因此，獲得的高大山羊草1Sl染色體特異分子標記可以應用于雜交群體的篩選、鑒定以及輔助選育子粒Fe和Zn元素含量高的高品質小麥。

關鍵詞：高大山羊草（Aegilops longissima）；1Sl染色體；分子標記；小麥育種

中圖分類號：Q78；S512.1+9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）20-4937-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.003

Construction of 1Sl Chromosome-specific Molecular Markers

in Aegilops longissima and Its Application

LIU Xiao-ming1a，ZHANG Shu-qian1b，GONG Wen-ying2，TANG Hai-tian3，WANG Can-guo2，

CHENG Dun-gong2，LIU Cheng2，LIU Jian-jun2

（1a. Research and Development Center of Biotechnology； 1b. School of Chemistry and Environment，Weifang University of Science and Technology， Weifang 262700， Shandong， China； 2.Crop Research Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China； 3.Yantai Oceanic Environmental Monitoring Central Station， Yantai 264006，Shandong，China）

Abstract：Since the wheat introduced Aegilops longissima 1Sl chromosome had significantly higher processing quality and higher content of iron and zinc in grain，the construction Aegilops longissima 1Sl-specific molecular markers was necessary and important for selecting and breeding high quality wheat which with high iron and zinc content. In this research，9 molecular markers specific for Aegilops longissima 1Sl were constructed，in which，2 markers located on the short arm，6 markers located on the long arm，and 1 marker located on both short and long arms.The verification experiment showed that the 9 markers were very available in screening and identifying isolated population.It indicated that the constructed 9 Aegilops longissima 1Sl chromosome-specific molecular markers could be used in cross population screening，identification and high quality wheat breeding.

Key words： Aegilops longissima； chromosome 1Sl； molecular marker； wheat breeding

全球有超過30億的人口處在體內缺Fe和Zn元素的“隱性饑餓”狀態下，有超過2.5億兒童不同程度缺乏Fe和Zn元素[1]。中國小麥子粒礦質元素尤其是Fe和Zn元素含量還不能滿足人們的基本需求[2]，因此，需要改良中國小麥礦質元素含量以及選育高品質小麥來改善人們的營養狀況。

高大山羊草（Aegilops longissima，2n=14，染色體組為SlSl），是小麥的遠緣物種及小麥育種的優異基因源，高抗小麥白粉病、葉銹病和麥二叉蚜、眼斑病，抗干旱脅迫和鹽脅迫，對小麥加工品質有顯著正效應[3]，能夠顯著提高小麥子粒Fe和Zn元素含量[4]。目前，抗小麥白粉病基因Pm13被定位在高大山羊草3Sl染色體短臂上，顯著提高小麥子粒Fe和Zn元素含量[4]、對小麥加工品質有顯著正效應的基因[5]和抗眼斑病主效QTL均定位在1Sl染色體上，因此，高大山羊草1Sl染色體分子標記的建立將對相應雜交群體的篩選與鑒定及輔助選育子粒Fe和Zn含量高的高品質小麥具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

一粒小麥（TA136）、圓錐小麥（TA10543）、高大山羊草（TA1910）、中國春-高大山羊草1S1附加系（TA3573）、中國春-高大山羊草2S1-7S1附加系（TA7544-TA7549）、中國春-高大山羊草1S1短臂（1SlS）和長臂（1SlL）端體附加系（TA7515和TA7516）和中國春1B單體（TA6550）由美國堪薩斯州立大學植物病理系Gill教授提供。中國春（CS）、綿陽11（MY11）和綿陽15（MY15）小麥由電子科技大學生命科學與技術學院楊足君教授提供。Aelon-1-Aelon-101是中國春1B缺體/中國春-高大山羊草1Sl附加系雜交F2群體。

1.2 DNA的提取

DNA的提取參照SDS法[6]。

1.3 引物設計與合成

從國際小麥EST定位工程網（http：//wheat.pw.usda.gov/NSF/data.html）選用120個已經被定位在小麥染色體第一同源群的EST序列為基礎設計EST-STS引物120對。第一同源群的EST-SSR引物22對、COS引物30對、PLUG引物42對和SSR引物16對的設計分別參照文獻[7-10]。上述引物均由成都瑞信生物公司合成。

1.4 PCR擴增與電泳

EST-STS引物擴增及電泳條件參照文獻[11]，EST-SSR引物、COS引物、PLUG引物和SSR引物擴增及電泳條件分別參照文獻[7-10]。

2 結果與分析

2.1 篩選高大山羊草1Sl染色體特異DNA片段

以中國春-高大山羊草1Sl附加系與一粒小麥、圓錐小麥、MY11、MY15和CS共5個小麥對照為材料，提取其基因組DNA，用合成的230對引物對這6份材料進行PCR擴增，結果發現分別有6對EST-STS引物（BF200742、BE500714、BE489692、BF604958、BE585781和BG262882）、1對EST-SSR引物（MAG2137）和2對SSR引物（Xgwm135和Xgwm140）可以在中國春-高大山羊草1Sl附加系中擴增出特異DNA片段，而對照一粒小麥、圓錐小麥、MY11、MY15和CS則擴增不出這些片段，說明這些DNA片段均來自高大山羊草。其中，引物BG262882和MAG2137的擴增結果見圖1A和圖1D。PLUG引物和COS引物則沒有在材料中擴增出多態性。

2.2 高大山羊草1Sl單染色體特異片段的驗證

為了驗證上述獲得的特異片段僅分別分布在1Sl染色體上，以中國春-高大山羊草1Sl-7Sl附加系和對照CS為材料，用上述獲得的9對引物進行擴增，發現這9對引物僅能在中國春-高大山羊草1Sl附加系中擴增出目標特異片段，而其余6個附加系和CS均未擴增出相應片段，說明這些片段為高大山羊草1Sl染色體特異標記。其中，引物BG262882 和引物MAG2137的擴增結果見圖1B和圖1E。

2.3 高大山羊草1Sl單染色體臂特異標記的建立

為了進一步將獲得的9個第一同源群標記定位在高大山羊草染色體臂上，以中國春-高大山羊草1SlS和1SlL端體附加系為材料，用上述9對引物對其擴增，結果發現這9個標記中，2個被定位在高大山羊草1Sl短臂（1S1S）上，6個被定位在1Sl長臂（1SlL）上，1個標記同時定位在1Sl短臂和長臂上（表1）。其中，引物BG262882 和引物MAG2137的擴增結果見圖1C和圖1F。

2.4 獲得標記對雜交群體的篩選與鑒定

為了驗證獲得標記的實用性，從中國春1B單體（2n=41）后代中篩選出染色體數目2n=40的1B缺體植株。將中國春-高大山羊草1Sl附加系與1B缺體進行雜交，其雜交F1中因為存在1B和1Sl雙單體，不能正常配對，因此，1B和1Sl容易在著絲粒處發生斷裂并重接。利用獲得的高大山羊草1Sl標記對中國春-高大山羊草1Sl/1B缺體雜交F2的部分分離群體進行篩選。參試的101個單株中，Aelon-1、Aelon-19和Aelon-20等31個植株可以擴增出1S1長臂標記，但是不能擴增出短臂標記（圖2），說明這31個植株中只含有1Sl長臂染色體而沒有1Sl短臂染色體。Aelon-5、Aelon-7和Aelon-17等35個植株不能擴增出1Sl長臂標記，但是可以擴增出短臂標記（圖2），說明這35個植株中不含1Sl長臂染色體而含有1Sl短臂染色體。Aelon-9、Aelon-12和Aelon-52等10個植株不能擴增1Sl長臂標記，也不能擴增出1Sl短臂標記（圖2），說明這10個植株中不含有1Sl染色體。Aelon-4、Aelon-6和Aelon-8等25個植株既能擴增1Sl長臂標記，也能擴增出1Sl短臂標記（圖2），說明這25個植株中含有1Sl染色體或同時含有1Sl染色體長臂和短臂端體。

3 討論與結論

本研究發現基于EST序列的COS引物和PLUG引物并沒有在供試材料中獲得多態性，而EST序列的EST-STS引物和EST-SSR引物分別在供試材料中獲得了5.0%（6/120）和4.5%（1/22）的多態性，因此，基于EST序列的不同引物在小麥外緣物種多態性標記建立效率方面也各有不同。基于微衛星序列的SSR引物在供試材料中獲得了12.5%（2/16）的多態性，說明在小麥外緣物種多態性標記建立方面，基于基因和非基因水平的序列均應考慮在內。

在高大山羊草染色體標記建立方面，劉旭等[11]建立了高大山羊草基因組RAPD標記5個；Milletet等[12]建立了高大山羊草5Sl染色體的同工酶標記；Neelam等[13]建立了2Sl染色體微衛星標記3個和7S1染色體標記4個；覃碧等[10]建立了2SlL染色體EST-STS標記5個；Cenci等[14]建立了3SlS染色體上與抗白粉病基因Pm13連鎖的分子標記。未見對1Sl染色體分子標記建立的報道。本研究建立了1Sl染色體分子新標記9個，并且將9個標記被分別定位在1Sl染色體短臂或長臂上。重復試驗表明，標記BE489692-EST-STS同時存在于1Sl短臂和長臂上，說明相應基因在1Sl染色體長臂或短臂上可能存在復制現象或1Sl長短臂上存在引物結合位點類似序列導致可重復性非特異擴增。對相應雜交群體的篩選結果表明，本研究建立的9個標記均能有效應用于分離群體的篩選和鑒定，可應用于涉及高大山羊草1Sl染色質導入小麥改良小麥子粒Fe和Zn含量選育高品質小麥的育種工作。

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