雞源產氣莢膜梭菌a毒素基因克隆表達及免疫原性的初步研究

張蓉蓉 艾地云 張騰飛 等

摘要：從雞源產氣莢膜梭菌C57-86中PCR擴增出a毒素基因，構建了表達質粒pGEXKG-a，并進行核苷酸序列進化分析。結果表明，雞源產氣莢膜梭菌的a毒素基因與參考菌株strainAL08-16相似性較高，核苷酸同源性為97.7%。對重組菌株BL21/KG-a誘導的表達產物進行了SDS-PAGE分析，重組菌株BL21/KG-a可以高效地表達毒素蛋白質；免疫試驗表明，表達產物免疫的SPF試驗雞可抵抗A型產氣莢膜梭菌的攻擊。

關鍵詞：產氣莢膜梭菌；a毒素；克隆表達；免疫原性

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）20-5152-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.057

Molecular Cloning and Immunogenicity of the alpha-toxin of

Clostridium Perfringens Isolated from Poultry

ZHANG Rong-rong，AI Di-yun，ZHANG Teng-fei，LUO Qing-ping，WEN Guo-yuan，WANG Hong-Lin，

WANG Hong-cai，LUO Ling，SHAO Hua-bin

（Insitude of Animal Husbandry and Veterinary， Hubei Academy of Academy of Agricultural Sciences/Hubei Key Laboratory of

Animal Embryo and Molecular Breeding，Wuhan 430064， China）

Abstract： The gene CPA encoding a toxin was amplified from the strain C57-86 separated from poutry of Clostridium Perfringens type A by PCR， and pGEXKG-a was constructed. The sequence analysis based on the alpha-toxin gene revealed the strain was most closely related to reference strain AL08-16 gene sequence， only 97.7% nucleotide identity was observed. The purposed protein was expressed efficiently， and the purposed protein could react with antitoxin antibody which protected the SPF chick against the attack of C.perfringens type A culture filtrate.

Key words：Clostridium perfringens； alpha-toxin； molecular cloning and expression； immunogenicity

產氣莢膜梭菌（Closteridium perfringens）是引起多種動物壞死性腸炎、腸毒血癥和人類食物中毒的主要病原菌之一，分為A、B、C、D、E 5個血清型。其致病因子主要是菌體產生的外毒素，在產氣莢膜梭菌所產生的12種毒素中，a毒素（CPA）被認為是最基本、最重要的致病因子。a毒素是由370個氨基酸組成的單鏈多肽，分子質量約43 ku，是一種依賴于鋅離子的多功能性金屬酶，具有磷脂酶C（PLC）和鞘磷脂酶2種酶活性，能同時水解細胞膜的主要組成成分——磷脂酰膽堿和鞘磷脂，破壞細胞膜的完整性，導致細胞裂解，從而具有細胞毒性、溶血性、致死性和皮膚壞死性等特性[1]。近年來，全國各地A型和C型產氣莢膜梭菌引起的不同日齡禽類嚴重的壞死性腸炎，發病率達30%以上，病死率達18%～31%，病死雞多為肌肉脂肪豐滿、體格健壯的雞。本研究克隆和表達了雞源產氣莢膜梭菌a毒素基因，并初步對其表達產物進行了序列分析及免疫原性研究，為下一步建立家禽壞死性腸炎的免疫學診斷方法及亞單位疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 雞源產氣莢膜梭菌強毒株strainC57-86購自中國獸藥監察所；大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）以及pGEX-KG載體由湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所保存。

1.1.2 主要試劑 限制性核酸內切酶BamHⅠ、XhoⅠ，PCR試劑盒RNaseA、Taq DNA聚合酶均購自寶生物工程（大連）有限公司；細菌DNA提取試劑盒購自OMEGA公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 參照NCBI中產氣莢膜梭菌a毒素全基因組序列，設計1對a毒素基因引物，上游引物CPa01： 5-ACGGGATCCCACTATTTTGGAGATATA

GA-3，下游引物CPa02：5-ACGCTCGAGTTAATTATAAGTTGAATTTCCTG-3，目的片段大小為729 bp，由生工生物工程（上海）有限公司合成。上游引物和下游引物分別含有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點。

1.2.2 全基因組的提取 將雞源產氣莢膜梭菌在厭氣肉肝湯中于37 ℃厭氧培養過夜離心后，將沉淀重懸于含2 mg/mL溶菌酶的TE溶液中，混勻后30 ℃水浴10 min。按照OMEGE bacterial DNA Kit說明書進行全基因組的提取。

1.2.3 PCR擴增 50 μL PCR反應體系為：10×Buffer緩沖液5.0 μL，MgCL2（25 mmol/L）4.0 μL，dNTPs（10 mmol/L）1.0 μL，模板5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL、Taq DNA聚合酶（25 U）1.0 μL，加滅菌雙蒸水補足至50 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。取5.0 μL PCR產物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。

1.2.4 PCR產物的回收、連接轉化及鑒定 PCR產物經1.0%瓊脂凝膠電泳回收后，以DNA膠回收試劑盒回收PCR產物，按說明書操作。將回收純化的目的產物與pGEX-KG載體雙酶切后，轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，以含有氨芐西林（Amp）抗性平板進行篩選培養，挑取白色菌落于含Amp的LB液體培養基上培養過夜，以SDS堿裂解法提取重組質粒，經PCR鑒定及BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切分析篩選陽性克隆。

1.2.5 序列的測定與分析 取陽性克隆菌送至生工生物工程（上海）有限公司測序，測序結果用BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）在線進行同源搜索。核苷酸和氨基酸分別用DNAStar軟件中的MegAlign程序的Clustal W運算，結果用GeneDoc2.6 （http：//www.psc.edu/biomed/genedoc/）進行核苷酸變異分析，分析所用菌株及其GenBank登錄號見表1。

1.2.6 陽性質粒的誘導表達及表達產物的SDS-PAGE分析 將構建的陽性質粒轉入受體菌BL21（DE3），經37℃加IPTG誘導，按文獻[2]的方法收集菌體，變性處理后進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.7 動物免疫原性及攻毒試驗 取陽性質粒表達的蛋白質測定其濃度，與等體積弗氏完全佐劑混勻乳化，制備抗原。取20只30日齡SPF雞，分為兩組，其中一組以600 μg劑量腿部肌肉注射SPF試驗雞，2周后取適量蛋白質與等體積不完全弗氏佐劑混勻并乳化完全后，以同種劑量加強免疫，另一組為生理鹽水免疫的空白組。將過夜培養的雞源A型產氣莢膜梭菌上清作倍比稀釋，從原液到10-4稀釋做5個梯度，每個稀釋度0.1 mL腿部肌肉注射30日齡SPF雞6只，觀察試驗雞存活情況。

2 結果與分析

2.1 PCR鑒定結果

采用設計的特異性引物對a毒素基因進行PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳。結果表明，以產氣莢膜梭菌為模板擴增出約729 bp的特異性條帶，與預期大小相符（圖1）。

2.2 重組質粒的雙酶切鑒定

將質粒經PCR鑒定后用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ進行酶切鑒定，結果如圖2所示。由圖2可知，經雙酶切后可獲得大小約為5 000 bp和729 bp的2條DNA條帶，即pGEX-KG載體和目的基因條帶，初步表明已成功構建產氣莢膜梭菌a毒素克隆表達質粒。

2.3 序列的測定與分析

將該菌株的a毒素基因序列與表1中的產氣莢膜梭菌[3]進行同源性比較，結果表明，雞源產氣莢膜梭菌a毒素基因與參考菌株AL08-16[4]的核苷酸同源性均較高，為97.7%。

基于基因組序列建立的進化樹（圖3），結果雞源產氣莢膜梭菌C57-86與印度土壤中分離的AL08-16的親緣關系較近，分別處于一較小的分支。與日本報道的ATCC13124和NCTC8237的親緣關系較遠。

2.4 a毒素基因表達產物SDS-PAGE分析

將BL21（DE3）菌株作為表達的宿主菌，經轉化挑取單個菌落培養誘導后，菌體經超聲波處理，提取包涵體，上清經80%飽和硫酸銨沉淀后得到濃縮，沉淀經透析后，用SDS-PAGE分析（圖4），在相對分子質量約為46 ku處出現特異性蛋白質條帶，表明a毒素已在宿主菌種得以表達，并且上清和沉淀均表達a毒素，包涵體中的濃度大于上清。

2.5 攻毒試驗結果

以1個LD50劑量，腹腔感染2次、免疫2周后的SPF雞及對照組SPF雞各10只，結果表明，免疫組10只SPF試驗雞全部存活，獲得100%的保護，而對照組10只SPF試驗雞全部死亡。

3 小結與討論

雞壞死性腸炎是由A型產氣莢膜梭菌引起的一種常見禽病，以生長率降低、腸道損傷和死亡為特征[5]。自2006年歐盟立法禁止抗生素作為生長促進劑（AGPs）添加到飼料中使用[6，7]后，雞壞死性腸炎發病率明顯增高，對全球養禽業造成了巨大的經濟損失。雞群發病較突然，常常是突然患病，剖檢可見大多數雞的腸腔擴張3～5倍并充滿氣體，十二指腸出血性腸炎，腸黏膜充血、出血或壞死。

本試驗成功克隆了雞源產氣莢膜梭菌a毒素的功能基因，并在大腸桿菌中高效表達，高表達的菌液經離心后提取包涵體，結果表明，構建的陽性克隆既可表達具有生物學活性的可溶性蛋白質，也可表達不可溶性蛋白質，這可能與設計a毒素的所選取的片段有關。a毒素基因其結構基因大小為1 194 bp，編碼398個氨基酸，分子質量為46 ku，信號肽為28個氨基酸，成熟肽為370個氨基酸。已有相關研究表明，編碼a毒素N端1～249氨基酸基因和編碼a毒素C端247～370氨基酸的基因，這兩種基因表達產物的生物學點效應有所變化[8]。通過免疫試驗表明，該重組蛋白質免疫SPF雞能產生很好的抗體，從而避免被A型雞源產氣莢膜梭菌的強毒株攻擊。

參考文獻：

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