奶母果對腎陽虛大鼠下丘腦-垂體-性腺軸中鈣調蛋白mRNA表達量的影響

余世榮

（湖北醫藥學院附屬人民醫院藥學部，湖北十堰442000）

奶母果對腎陽虛大鼠下丘腦-垂體-性腺軸中鈣調蛋白mRNA表達量的影響

余世榮

（湖北醫藥學院附屬人民醫院藥學部，湖北十堰442000）

目的研究奶母果對腎陽虛大鼠模型下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸鈣調蛋白（CaM）mRNA表達量的影響。方法應用外源性糖皮質激素（氫化可的松）制作腎陽虛大鼠模型，檢測各組大鼠HPG軸中CaM mRNA表達量，分析奶母果對HPG軸中下丘腦、睪丸CaM mRNA的影響。結果高劑量的奶母果癭果可提高腎陽虛大鼠HPG軸下丘腦CaM mRNA的表達量，降低睪丸CaM mRNA的表達量，而奶母果癭果低劑量組和花序托組作用不明顯。結論奶母果可通過提高腎陽虛大鼠下丘腦CaM mRNA的表達改善其腎陽虛癥狀。

奶母果；鈣調蛋白；下丘腦-垂體-性腺軸；鈣調蛋白mRNA

奶母果又名薜荔果，為?？崎艑僦参镛道驠icus pumila Linn.Var.pumila干燥成熟的雄性隱花果，有補腎固精、催乳、散毒之功效，主治腎虛遺精、小便淋濁、陽痿、閉經、疝氣、乳汁不下、久痢癰腫等證［1-2］。奶母果由癭果、雄花和花序托組成，癭果內含不同發育階段的薜荔榕小蜂，但各文獻對奶母果藥用部位的記載不盡相同［3-4］。柯尊瓊等［5］的研究表明，奶母果能改善腎陽虛大鼠體征，降低血清雌二醇（E2）水平，提高睪酮（T）水平使之恢復接近正常值，延長腎陽虛大鼠負重游泳時間，并可糾正腎陽虛大鼠睪丸的病理性腫大和體重下降趨勢，與花序托相比，其補腎作用優于后者。奶母果水提物還可提高免疫低下小鼠的胸腺指數和脾臟指數，增強免疫低下小鼠的免疫功能［6］。本研究中采用氫化可的松肌肉注射復制腎陽虛大鼠模型［7］，觀察奶母果中癭果和花序托對腎陽虛大鼠下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸的調節作用，以期從分子水平闡述奶母果補腎作用機制及癭果和花序托藥理作用的差異。

1 材料與方法

1.1儀器、試藥與動物

儀器設備：PCR儀（Biometra，德國）；高速冷凍離心機（Hettich Universal，德國）；超低溫冰箱（-80℃，Sanyo，日本）；紫外凝膠圖像分析儀（上海天呈科技有限公司）；臺式高速冷凍離心機（Hettich，德國）。

藥品與試劑：注射用氫化可的松琥珀酸鈉（天津生物化學制藥有限公司，批號為20080509）；滅菌注射用水（漯河市方匯藥業有限公司）；淫羊藿、奶母果（十堰市中藥材公司，批號分別為091001，090901）均經湖北醫藥學院藥學院張曉燕副教授鑒定為正品。TRIZOL試劑盒（Invitrogen，美國）；逆轉錄和擴增試劑盒（Fermentas Life Science，加拿大）；引物合成、DNA marker（北京賽百盛生物科技有限公司）；瓊脂糖（Biowest公司，上海Yito公司分裝）；溴化乙錠（EB，上海生工生物技術有限公司）；其他試劑均為分析純。

試驗動物：SPF級SD雄性大鼠70只，體重（220±30）g，由湖北醫藥學院實驗動物中心提供，許可證號為［SCXK（鄂）2005-0008］；動物在屏障系統環境下用專用的飼料和滅菌水分籠飼養，試驗動物使用許可證號為［SYXK（鄂）2004-0021］。

1.2 方法

1.2.1 藥品配制

分別取一定量的花序托、癭果和淫羊藿加適量的水浸泡，煎煮3遍，每遍1 h，煎液合并，各濃縮成每1 mL相當于1 g原藥材的濃縮液，分裝成每袋20 mL，臨用時配制成需要的質量濃度；注射用氫化可的松琥珀酸鈉臨用時配制成25 g/L。

1.2.2 造模、分組與給藥

SPF級SD大鼠70只，適應性喂養7 d后，隨機分為陽性藥物（淫羊藿）對照組（ESM組）、正常組（N組）、腎陽虛模型組（DM組）、花序托低劑量組（RMSFP-L組）、花序托高劑量組（RMSFP-H組）、癭果低劑量組（SGMSFP-L組）、癭果高劑量組（SGMSFP-H組），每組10只，各組給藥體積均為10 mL/kg。除正常組外，其他各組大鼠每日肌肉注射氫化可的松25 mg/kg，連續15 d，正常組大鼠肌肉注射等體積的0.9%氯化鈉注射液。大劑量外源性糖皮質激素（如氫化可的松）可使垂體前葉促腎上腺皮質激素（ACTH）釋放受抑，進而使腎上腺皮質分泌類固醇激素減少，促進大鼠蛋白質、脂肪分解，降低糖利用及抑制免疫作用，而出現“耗竭”現象，表現為體重減輕、活動減少、反應遲頓、肢尾冷、蜷曲拱背、松毛等畏寒肢冷的陽虛現象甚至死亡。制作模型的同時灌胃給藥，正常組和模型組同時灌服蒸餾水2 mL/d；癭果組、花序托組的低、高劑量組分別灌服12.0，24.0 g/（kg·d）濃縮液和陽性藥物組灌服12.0 g/（kg·d）淫羊藿濃縮液。大鼠造模后第15天，脫臼處死，取出下丘腦、睪丸，以濾紙吸去表面殘血，迅速于-70℃低溫保存。

1.2.3 RT-PCR法檢測鈣調蛋白（CaM）的表達

引物設計：從Gene Bank中查出大鼠CaM基因和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的序列，設計引物。CaM的上游引物為5'-GGCATCCTGCTTTAGCCTGAG-3'（length21），下游引物為5'-ACATGCTATCCCTCTCGTGTGAC-3'（length23），擴增片段為328 bp。大鼠GAPDH上游引物［3］為5'-CCAAAAGGGTCATCATCTCC-3'，下游引物為5'-GTAGGCCATGAGGTCCACCAC-3'，擴增片段為623 bp。

DNA提取：-70℃凍存的大鼠下丘腦、睪丸組織標本各取5個，精密稱?。?0±5）mg，分別置5 mL eppendorf（EP）管內，加入TRIZOL 1 mL，剪碎，充分勻漿，收集入1.5 mL EP管，冰上放置5 min，再加氯仿，混合均勻，于12 000 r/min離心15 min，吸取上清液于另一1.5mLEP管，加入異丙醇冰上放置30min，于14000r/min離心10min后棄上清液，再向管中加入75%乙醇洗滌，于14000 r/min離心5 min，棄上清液，將EP管倒置在濾紙上自然揮發乙醇，管底RNA用焦碳酸二乙酯水（DEPC）溶解。取RNA溶液2 μL，加DEPC水198 μL，以DEPC水為空白管，紫外分光光度計測定總RNA純度（A260/A280為1.5～2.0）。結果RNA純度為1.7，符合要求。

逆轉錄：取處理好的200 μL EP管，每管平均加入一定量DEPC和Oligo dT 1 μL，再加入一定體積的RNA，混勻，低速離心輕甩，上機65℃5 min，取出置冰上每管加入（5×buffer 4 μL、10 mm dNTP 2 μL、RNase 1 μL、M-MuLV RT 1 μL），震蕩混勻，低速離心輕甩，上機逆轉錄（42℃1 h，70℃10 min）。反應完成后取出冰浴，于-20℃保存。

聚合酶鏈反應（PCR）擴增反應體系：取處理好的200 μL EP管，每管分別加入DEPC水90 μL，cDNA 10 μL稀釋混勻。取擴增體系（2×Mix 10 μL、上下游引物各2 μL），分別加入相應cDNA稀釋液6 μL，低速離心輕甩。設定反應條件為，預變性94℃5 min；變性94℃40 s；退火58℃40 s；延伸72℃40 s，26個循環；最終延伸72℃10 min；儲存4℃10 min。反應完成后取出后冰浴，于-20℃保存。

瓊脂糖凝膠電泳：取1.5%的瓊脂糖加入裝有硼酸（TBE）緩沖液的燒瓶中煮沸，溶解，冷卻到50～60℃加入1‰的EB混勻后，緩慢倒入放在4℃的冰箱中的膠槽中30 min，取出。放入電泳槽，膠孔放在靠陰極側，倒入TBE緩沖液浸沒凝膠。取出儲存的PCR產物，每管加4 μL 6×loading Buffer，混勻，取15～20 μL進行點樣，預留1號孔加10 μL Marker作為對照；在60～70 V恒定電壓下電泳分離PCR產物。

CaM表達量的測定：各組CaM和GADPH mRNA在條帶應有顯示。將下丘腦和睪丸的電泳條帶圖應用凝膠成像系統拍攝，以內參GADPH條帶確定CaM的精確區域［8］。采用生物醫學影像分析軟件ImageJ 1.43測量電泳的灰度，計算相對含量（相對含量= CaM條帶灰度/內參條帶灰度）。

1.3 統計學處理

2 結果

各組相對于Marker在328 bp（CaM mRNA），623 bp（GADPH mRNA）均有條帶。電泳圖表明，所擴增片段睪丸CaM mRNA（328 bp），GADPH mRNA（623 bp）為特異性擴增（見圖1），下丘腦CaM mRNA（328 bp），GADPH mRNA（623 bp）為特異性擴增（見圖2）。CaM mRNA相對含量見表1?？梢姡琒GMSFP-H組能極顯著提高腎陽虛大鼠下丘腦的CaM mRNA表達量（P＜0.01），而SGMSFP-L組無明顯差異。

圖1 各組睪丸CaM mRNA和GAPDH mRNA表達的電泳圖

圖2 各組下丘腦CaM mRNA和GAPDH mRNA表達的電泳圖

表1 各組睪丸、下丘腦的CaM mRNA相對含量比較

3 討論

臨床腎陽虛患者腎上腺皮質功能低下，需長期使用大劑量外源性皮質激素，同時長期大量腎上腺皮質激素治療可致下丘腦-垂體-腎上腺反饋抑制，當皮質激素突然停用，HPG軸的抑制狀態即暴露出來，表現不同程度的HPG軸功能低下［9］，出現腎陽虛證。試驗以此為依據復制了腎陽虛大鼠模型。

CaM是一種多功能的Ca受體蛋白，通過與Ca2+結合形成復合物而介導許多功能蛋白和結構蛋白的相互作用，從而參與各種細胞功能調控，引起一系列生理生化反應，在細胞信號轉導中起非常重要的作用［10］。Iwamoto等［11］的研究表明，CaM除調節細胞周期和啟動DNA合成外，還能通過調節蛋白質的磷酸化和脫磷酸化來刺激某些細胞合成RNA；并且分別激活腺苷環化酶和磷酸二酯酶影響cAMP來調節細胞分化增殖，從而影響cAMP代謝。有研究已證明，可通過測量CaM在HPG軸中的表達量來觀察HPG軸的功能［12］。

本研究結果顯示，模型組大鼠睪丸組織中CaM的相對表達明顯高于正常組，而下丘腦中CaM mRNA的表達則無明顯改變。這提示睪丸中的Ca過度表達與腎陽虛證密切相關。性器官功能低下是腎陽虛的主證之一，CaM在性腺的過度表達，也是性器官功能損傷的表現之一［12］，本研究結果與之相符。同時，本研究結果提示，CaM在睪丸中的表達，癭果低、高劑量組與模型組都有顯著性差異，但與淫羊藿組和正常組無顯著性差異，進一步表明奶母果的補腎藥用部位癭果優于花序托。

綜上所述，奶母果可通過降低腎陽虛大鼠睪丸CaM mRNA的表達量，提高下丘腦CaM mRNA的表達量而改善其腎陽虛癥狀，提高腎陽虛大鼠的存活率和生命質量，對陰損及陽的腎陽虛證，有較顯著的補益腎陽功效。但其作用機制仍需進一步研究證實。

［1］中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志第二十三卷第一分冊［M］.北京：科學出版社，1998：205.

［2］湖北省食品藥品監督管理局.湖北省中藥材質量標準（2009版）［M］.武漢：湖北科學技術出版社，2009：46-47.

［3］全國中草藥匯編編寫組.全國中草藥匯編［M］.北京：人民衛生出版社，1996：923.

［4］湖北省衛生廳.湖北省中藥炮制規范［M］.武漢：湖北科學技術出版社，1989：125.

［5］柯尊瓊，宋根偉，馬杰，等.奶母果兩個部位補腎壯陽作用的比較［J］.廣東藥學院學報，2011，27（1）：74-76.

［6］王文瑛，汪選斌，張曉燕，等.奶母果水提物對免疫低下小鼠胸腺和脾臟系數的影響［J］.現代中西醫結合雜志，2012，21（3）：250-251.

［7］丁月妮，宋根偉，劉華，等.奶母果對腎陽虛大鼠影響的實驗研究［J］.湖北醫藥學院學報，2011，30（2）：131-133.

［8］索佳佳，張保珍，孫春玲，等.鈣調蛋白（CaM）對附植前小鼠胚胎熱休克蛋白70（HSP70）表達的影響［J］.農業生物技術學報，2013，21（6）：690-697.

［9］鄭海生，蔣健，賈偉.中醫學腎陽虛證的現代化研究概述［J］.遼寧中醫雜志，2007，34（7）：1 014-1 016.

［10］Gannon MN，Mcewen BS.Distribution and regulation of calmodulin mRNA in rat brain［J］.Mol Brain Res，1994，22（1-4）：186-192.

［11］Iwamoto N，Lu R，Tanaka N，et al.Calmodulin interacts with ATP binding cassette tansporter A1 to proctect from calpain-Mediated degradation andupregulateshigh-densityLiporoteingeneration［J］.ArteriosclerThromb Vasc Biol，2010，13（5）：1 446-1 452.

［12］康白，段鵬，韓慧蓉，等.二甲雙胍對大鼠垂體-性腺軸鈣調蛋白mRNA表達的影響［J］.中國藥理學通報，2007，23（4）：521-523.

Influence of Ficus Pumila Linn.on Calmodulin mRNA Expression Level in Hypothalamic-Pituitary-Gonadal Axis of Rats with Kidney-Yang Deficiency

Yu Shirong
（Department of Pharmacy，The Affiliated Renmin Hospital of Hubei University of Medicine，Shiyan，Hubei，China 442000）

ObjectiveTo study the influence of Ficus pumila Linn.（FPL）on calmodulin mRNA expression level in hypothalamic-pituitary-gonadal（HPG）axis of rats with kidney-yang deficiency.MethodsRats with kidney-yang deficiency were induced by exogenous glucocorticoids（Hydrocortisone）to analyze the influence of FPL on calmodulin mRNA expression level in hypothalamic-pituitarygonadal axis function by detecting calmodulin mRNA expression level in HPG axis.ResultsHigh dose of FPL had obvious regulating effect on calmodulin mRNA expression level in HPG axis of rats with kidney-yang deficiency.ConclusionFPL can tonify the kidney by regulating calmodulin mRNA expression level in HPG axis of rats with kidney-yang deficiency.

Ficus pumila Linn.；calmodulin；hypothalamic-pituitary-gonadal axis；calmodulin mRNA

R285.5；R282.71

A

1006-4931（2015）20-0056-03

2015-01-27）