新型基因重組藻膽蛋白對小鼠S180實體瘤突變型P53表達的影響

張曉平，張文平，侯林，田景振

（1.山東中醫藥大學藥學院，山東濟南250355；2.云南中醫學院藥學院，云南昆明650500）

新型基因重組藻膽蛋白對小鼠S180實體瘤突變型P53表達的影響

張曉平1，張文平2，侯林1，田景振1

（1.山東中醫藥大學藥學院，山東濟南250355；2.云南中醫學院藥學院，云南昆明650500）

目的探討新型基因重組藻膽蛋白對小鼠S180實體瘤突變型P53表達的影響。方法將小鼠腋下接種S180細胞荷瘤造模后，隨機分為陰性組，環磷酰胺組，新型基因重組藻膽蛋白組［50 mg/（kg·d）］，天然藻藍蛋白低、高濃度組［25，100 mg/（kg·d）］，共5組，陰性組給予等量生理鹽水，靜脈注射給藥11 d后處死，剝離腫瘤，采用免疫組化方法檢測腫瘤組織中突變型P53的表達。結果新型基因重組藻膽蛋白組，天然藻藍蛋白低、高濃度組突變型P53平均陽性表達率分別為12.28%，18.76%，15.80%，均低于陰性組的60.08%（P＜0.05）。結論新型基因重組藻膽蛋白可明顯抑制突變型P53表達（P＜0.05），可能對突變型P53表達有下調作用。

新型基因重組藻膽蛋白；突變型P53；表達

藻膽蛋白（phycobiliprotein）是主要來自真核藻類的一種捕光色素蛋白，在抗腫瘤、抗氧化等方面活性較高，有開發成為藥物的極大潛力［1］，新型基因重組藻膽蛋白可解決藥物開發過程中成本高、雜質多、周期長的問題。藻膽蛋白抗腫瘤功效已見大量報道［2-3］，但其抗腫瘤作用機制仍不明確。本研究中利用免疫組化方法研究新型藻膽蛋白與腫瘤密切相關的P53蛋白表達量的關系，并探討藻膽蛋白抑制腫瘤生長的方式與途徑，為開發新的海洋藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物、試藥及儀器

動物及瘤株：清潔級昆明小鼠50只，體重18～23 g，雄性，由山東魯抗醫藥股份有限公司質檢中心實驗動物室提供，動物合格證編號SCXK（魯）20080002。小鼠S180實體瘤細胞，購于上海市細胞研究所，采用常規方法小鼠體內腹腔傳代。

藥品與試劑：新型基因重組藻膽蛋白（實驗室自制）；藻藍蛋白從螺旋藻中提?。ㄊ称芳壜菪宸?，購自江蘇賜百年公司）；注射用環磷酰胺（CY，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，規格為每瓶0.2 g）；蘇木色精（上海藍季科技發展有限公司）；30%過氧化氫（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；兔抗小鼠P53多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；SABC試劑盒（包括生物素化山羊抗兔IgG 5%即用型BSA SABC工作液，武漢博士德生物工程有限公司）；DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

儀器：KD-202輪轉式切片機（浙江省金華市科技儀器設備有限公司）；生物圖像分析系統（江蘇捷達科技公司提供），OLYMPUS-BX50顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；ZMN-7803型自動組織包埋機（常州華利電子公司）；Simple PCI圖像分析系統（V5.2，CompixInc，美國）。

1.2 方法

腫瘤動物模型的建立［4］：將凍存的S180肉瘤細胞復蘇活化，并傳代4代。無菌抽取S180肉瘤小鼠腹腔積液，高壓滅菌，稀釋，以每只0.2 mL在小鼠腋下注射，24 h后隨機分5組。陰性組給予生理鹽水0.5 mL灌胃；新型基因重組藻膽蛋白組按50 mg/（kg·d）；天然藻藍蛋白按25，100 mg/（kg·d）分為高、低濃度組灌胃給藥，環磷酰胺組30 mg/（kg·d）腹腔注射，每日1次，連續給藥11 d。末次給藥24 h后，處死剝瘤。

免疫組化過程：將腫瘤放入固定液中保存，病理常規脫水，石蠟包埋，切片，切片滴加突變型P53多克隆抗體。將含腫瘤組織的的載玻片經脫蠟、復水后，用3%H2O2封閉內源性過氧化物酶活性，檸檬酸鹽微波15 min進行抗原修復，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，滴加正常BSA，置濕盒中37℃孵育20 min，甩凈液體，滴加突變型P53抗體（稀釋度為1∶150），4℃孵育過夜，滴加二抗生物素標記二抗工作液40～50 μL，37℃濕盒內孵育20 min，PBS清洗后滴加SABC工作液37℃濕盒中孵育20 min，加DAB充分顯色，顯色后蘇木精中復染2 min，處理，中性樹膠封片。

突變型P53表達的檢測：選擇5個高倍視野，每個分別計數約500個細胞，取陽性顯色平均數并評分。若著色較深定為2分，著淡色定為1分，基本上不著色定為0分。著色細胞占計數細胞的百分率≥51%為3分，26%～50%為2分，6%～25%為1分，≤5%為0分［5］。每張切片染色細胞的百分率得分染色程度的乘積為其最終得分。P53陽性細胞以細胞核著棕黃色為判定標準。

光鏡檢查：免疫組化后切片鏡檢，觀察各腫瘤細胞生長情況。

1.3 統計學處理

采用Simple PCI圖像分析系統對免疫組化結果進行分析，SPSS 17.0軟件進行數據處理，多組數據比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用F檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

各用藥組小鼠S180實體瘤組織中P53表達與陰性組相比明顯減少（P＜0.05）；新型基因重組藻膽蛋白組與天然藻藍蛋白組相比明顯減少（P＜0.05），與環磷酰胺組相比差異不明顯（P＞0.05），結果見表1。突變型P53免疫組化主要在細胞核著色，呈棕黃色，或較淺的黃色。在顯微鏡下觀察可發現，陰性組細胞核在蘇木精復染后有一定程度的不規則現象，環磷酰胺組細胞核不規則程度較輕，新型基因重組藻膽蛋白組和天然藻藍蛋白組也有一定程度不規則性，結果見圖1。

表1 新型基因重組藻膽蛋白對突變型P53表達的影響

圖1 各組免疫組化P53顯微鏡下照片（×400）

3 討論

P53蛋白是一種基因調節蛋白，當DNA受到損傷時其表達急劇增加，表達主要在細胞核。P53蛋白分為野生型和突變型，野生型半衰期較短，不易檢測，可使DNA受損，細胞凋亡，調控細胞周期，促進細胞分化而抑制腫瘤；而突變型半衰期長，能引起細胞惡性增生和突變，使蛋白產物表達增加［6］，可用免疫組化方法檢測。本試驗中即用該法檢測突變型P53的表達情況。

本試驗結果顯示，陰性組中突變型P53陽性表達率最高，符合預期，其他各組對于突變型P53的表達均有明顯的下調作用（P＜0.05），新型基因重組藻膽蛋白組、天然藻藍蛋白組均與陰性組有顯著性差異。環磷酰胺組對腫瘤抑制作用最明顯，其次是新型基因重組藻膽蛋白組，天然藻藍蛋白純度越高抑瘤效果越好。

新型重組藻膽蛋白能抑制腫瘤細胞增殖，其作用機制可能與突變型P53的表達下調，減少其大量表達所造成的細胞分裂失去節制而使癌變增加，同時減少P53突變所造成的細胞周期監測點失去控制，及Bax/Bcl-2，Fas/Apol，IGF-BP3等蛋白對凋亡作用的失控有關，從而起到抑制腫瘤生長的作用。

［1］王庭健，林凡，趙方慶，等.藻膽蛋白及其在醫學中的應用［J］.植物生理學通訊，2006，42（2）：303-307.

［2］Manconia M，Pendás J，Ledón N，et al.Fadda Phycocyanin liposomes for topical anti-inflammatory activity：in-vitro in-vivo studies［J］.Journal of Pharmacy and Pharmacology，2009，61（4）：423-430.

［3］李冰，褚現明，高美華，等.鈍頂螺旋藻藻藍蛋白誘導Hela細胞凋亡的分子機制研究［J］.中國藥理學通報，2009，25（8）：1 045-1 050.

［4］吳蕾，龐廣昌，陳慶森.螺旋藻藻藍蛋白的規模化提取和色譜純化技術研究進展［J］.食品科學，2008，29（4）：461-463.

［5］陳智彬，宋永勝.Survivin、Caspase-3、突變型P53對膀胱移行細胞癌預后的意義［J］.實用醫學雜志，2009，25（3）：348-350.

［6］陸愛平，李吉友.DNA損傷修復能力、P53蛋白及增殖細胞核抗原在大腸癌發生過程中的變化［J］.中國腫瘤臨床，1997，2（12）：926-930.

Effect of New Recombinant Phycobiliprotein on Expression of P53 Mutant of Mice Treated with S180 Solid Tumor

Zhang Xiaoping1,Zhang Wenping2,Hou Lin1,Tian Jingzhen1
（1.Department of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan,Shandong,China250355；2.Department of Pharmacy，Yunnan University of TCM,Kunming,Yunnan,China650500）

ObjectiveTo explore the effect of new recombinant phycobiliprotein on the expression of P53 in mutant of mice treated with S180 solid tumor.MethodsThe tumor-bearing mice which were inoculated with S180 solid tumor were randomly divided into 5 groups：model group,cyclophosphamide group,new recombinant phycobiliprotein group［50 mg/（kg·d）］,low,high dose of phycocyanin group［25,100 mg/（kg·d）］,the same amount of sodium chloride injection was given to model group.After the intragastric administration for 11 d,the mice were put to death and the solid tumor was removed from each group,and the expression of P53 mutant was detected by immunohistochemical SABC method.ResultsThe average positive expression rates of P53 mutant among new recombinant phycobiliprotein group,low,high dose of phycocyanin group were 12.28%，18.76%，15.80%respectively,which were much lower than 60.08%of the model group（P＜0.05）.ConclusionNew recombinant phycobiliprotein may decrease the expression of P53 mutant significantly,and may have down-regulatory effect on the expression of P53 mutant.

new recombinant phycobiliprotein；P53 mutant；expression

R285.5；R282.77

A

1006-4931（2015）20-0028-03

張曉平（1987-），女，博士研究生，主要從事新藥開發與中藥炮制原理研究工作，（電子信箱）xia_opingzhang@ 126.com；田景振，男，博士研究生導師，研究方向為新藥開發與中藥炮制原理研究，本文通訊作者，（電話）0531-89628597（電子信箱）tianjingzhen@163.com。

2014-11-13）