英夫利西單抗治療克羅恩病黏膜愈合的血清差異蛋白質表達研究*

廖詩樂， 陳白莉， 胡坤華， 饒佩斯， 何 瑤， 黎明濤， 陳旻湖， 曾志榮△

克羅恩病(Crohn’s disease，CD)在我國日益多見［1］。英夫利西單抗(infliximab，IFX)是目前唯一能改變CD自然病程的藥物，其主要作用是可以誘導獲得黏膜愈合(mucosal healing，MH)，MH的CD患者住院率及手術率降低［2］。然而，IFX價格昂貴，如何能在治療前明確哪些患者經IFX治療能達到MH，將具有明顯的經濟效益比?；诖?，本研究采用蛋白質組學技術分析IFX獲得MH和未獲得MH患者血清蛋白表達的差異，為將來篩選預測的生物標志物奠定基礎。

材料和方法

1 研究對象

2012年9月～2013年9月中山大學附屬第一醫院炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases，IBD)中心確診的CD患者共14例。診斷標準采取我國的共識意見［3］?；颊呓o予 IFX 5 mg/kg，第 0、2 、6、14 周靜脈滴注給藥。于第10周復查腸鏡，根據克羅恩病內鏡嚴重程度指數(Crohn’s disease endoscopic index of severity，CDEIS)情況，將病人分為MH和黏膜未愈(non-MH)。MH定義為內鏡下未見潰瘍和(或)CDEIS評分＜3分，non-MH定義為內鏡下無應答，即CDEIS評分較前下降＜5分，潰瘍仍然存在［4］。采集7例MH患者治療前0周(A組)和治療后14周(B組)的靜脈血以及7例non-MH的CD患者0周(C組)和14周(D組)的靜脈血3 mL，4℃冰箱放置4 h，以3 000×g離心10 min，取上清樣本凍存于－80℃備用。

2 主要方法

2.1 血清樣本處理 去除大部分高豐度清蛋白、IgG和純化、定量蛋白。然后按說明書，每400 pmol的Dye熒光染料標記50 μg的蛋白質，Cy2標記內參照。采取混合樣本策略以消除個體差異，Cy3和Cy5交叉標記樣本，以消除不同熒光染料染色效力的誤差。A、B、C、D各組血清均在相同條件下重復4次。2.2 雙向差異凝膠電泳 (2D-DIGE) 上樣至固相pH值干膠條(IPGstrip pH 4～7，24 cm)，對血清樣品進行第1向等電聚焦(isoelectric focusing，IEF)電泳。IEF后，將完成平衡的IPG膠條放置于12.5%十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel，SDS-PAG)上緣，進行第 2向SDS-PAG電泳至溴酚藍達凝膠下緣。

2.3 2D-DIGE圖像分析 使用 Typhoon Scanner Control 5.0掃描儀軟件采集膠內蛋白差異圖像，采用DeCyder 6.0軟件對圖像進行自動分析，選取表達差異大于1.5倍、t檢驗P＜0.05的斑點作為差異表達蛋白質斑點行進一步質譜鑒定。

2.4 差異蛋白的MALDI-TOF/TOF-MS鑒定 Ettan全自動凝膠斑點處理工作站進行蛋白質斑點的切取、脫色、干燥、酶解。使用 Ultraflex III質譜儀(Bruker)對酶解液進行MALDI-TOF/TOF-MS分析，得到各斑點的肽質量指紋圖譜(peptide mass fingerprinting，PMF)和串聯質譜(tandem mass spectrometry，MS/MS)。使用Biotools軟件，以MASCOT(Matrix Science)為搜索引擎，在Swiss-Prot數據庫中檢索所獲的圖譜。

3 繪制STRING網絡功能圖

在 STRING 數據庫(http://www.string-db.org)提交蛋白質登記名，將所有差異表達的蛋白質都納入功能網絡分析，研究差異表達蛋白質所參與的路徑。

4 統計學處理

應用SPSS 13.0統計軟件分析患者資料，正態分布的變量用均數±標準差(mean±SD)表示，非正態分布的資料用中位數，極差(median，range)表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗或Mann-Whitney U檢驗，治療前后比較采用配對t檢驗或Wilcoxon檢驗。分類變量比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 一般情況

MH患者男性5例，女性2例，年齡(21.86±8.40)歲;non-MH患者男性4例，女性3例，年齡(19.14±5.90)歲。2組患者性別構成比、年齡、病程、疾病部位、疾病行為、用藥史、腸外表現等臨床特征均無統計學差異。2組超敏C反應蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)和紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)在0周時均無顯著差異，治療后MH組上述指標顯著低于non-MH組，也顯著低于MH組治療前0周的水平。CD活動指數(Crohn’s disease activity index，CDAI)在0 周時呈輕中度活動，2組無顯著差異;在14周時MH組達臨床緩解，與0周相比有顯著差異，且non-MH組與MH組相比有顯著差異。2組CDEIS評分在0周時無顯著差異，治療后存在顯著差異，見圖1、表1。

Figure 1. Typical colonoscopic images.A:MH(0 week)，CDEIS 22.4;B:MH(10 weeks)，CDEIS 1.4;C:non-MH(0 week)，CDEIS 18.6;D:non-MH(10 weeks)，CDEIS 15.2.圖1 典型腸鏡圖像

表1 患者的臨床資料Table 1.Clinical characteristics of CD patients with IFX therapy(n=7)

2 凝膠圖像差異分析

經DeCyder 6.0軟件處理后Cy2、Cy3和Cy5染色在圖像中分別為藍色、綠色和紅色。經DeCyder 6.0軟件分析檢測到1 505±177個蛋白質斑點，獲得的凝膠間匹配率為72.0%±0.2%。以斑點平均體積差異大于1.5倍(表達差異上調或下調1.5倍)，t檢驗P＜0.05的蛋白質點為有顯著差異的蛋白質點，經軟件統計分析，A組與B組之間、C組與D組之間、A組與C組之間以及B組與D組之間比較分別存在36、3、10和31個差異表達的蛋白質斑點，共計發現44個顯著差異表達的蛋白質斑點。顯著差異的蛋白斑點在2DDIGE凝膠上的具體位置見圖2。

Figure 2.Merged image of 2D-DIGE.圖2 融合的2D-DIGE凝膠圖像

3 質譜分析結果

差異表達的44個蛋白質點進行MALDI-TOF/TOF-MS質譜分析，以Mascot得分≥56分認為是可信結果，共鑒定出與27個差異點對應的19種蛋白質，見表2。

A組和B組比較鑒定出與25個差異點相對應的17種差異蛋白質，其中在B組上調表達的蛋白有6種，包括中心體蛋白57 kD樣1(centrosomal protein 57kD-like 1，CEP57L1)、角蛋白 2e(keratin，type II cytoskeletal 2 epidermal，CK-2e)、白蛋白(albumin，ALB)、載脂蛋白 E(apolipoprotein E，APOE)、載脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I，APOA1)和甲基化CpG結合域蛋白 4(methyl-CpG-binding domain protein 4，MBD4)，在B組下調表達的蛋白有11種，包括補體因子H(complement factor H，CFH)、銅藍蛋白(ceruloplasmin，CP)、α1-抗胰蛋白酶(alpha-1-antitrypsin，SERPINA1)等。

C組和D組比較鑒定出與3個差異點對應的2種差異蛋白質，CEP57L1和ALB均在D組上調表達;A組和C組比較鑒定出與2個差異點相對應的2種差異蛋白，Mago-Nashi同源蛋白(Mago-Nashi homolog protein，MAGOH)在A組上調表達，觸珠蛋白(haptoglobin，HP)在A組下調表達;B組和D組比較鑒定出與21個差異點對應的15種差異蛋白質，其中在B組上調表達的蛋白有6種，包括血清中α2-巨球蛋白(alpha-2-macroglobulin，A2M)、CK-2e、ALB、APOE、APOA1和MBD4，在B組的下調蛋白有9種，包括CFH、CP、原肌球蛋白α4鏈(tropomyosin alpha-4 chain，TPM4)等。

表2 經IFX治療的CD患者血清中的差異表達蛋白質Table 2.Differentially expressed proteins in the serum of CD patients with IFX treatment

4 蛋白質功能網絡分析

分別繪制得A-B之間和B-D之間差異表達蛋白相互作用的功能網絡圖，其中涉及APOA1以及周邊共12種蛋白的相互關系。不同顏色的線段表示不同類型的證據，見圖3。

討 論

CD的發病與遺傳、環境及腸道菌群有關［5］，系腸黏膜的慢性全層性炎癥。既往采用5-氨基水楊酸(5-ASA)、激素及免疫抑制劑治療，盡管臨床癥狀好轉，但腸道炎癥仍然持續，住院率及手術率高。1998年開始采用IFX治療CD。IFX促腸道黏膜的愈合，MH的獲得可以減少手術率和住院率，從而改變CD的自然病程。然而，IFX治療僅使約30%的患者獲得MH［6］，而且價格十分昂貴。因此，治療前如果能預測其MH，就有望解決目前臨床的需求。

本研究在國內首次運用蛋白質組學探究與IFX治療CD獲得MH可能相關的蛋白質。2D-DIGE圖像提示IFX的應用改變了CD患者的血清蛋白質表達圖譜，MALDI-TOF/TOF-MS鑒定得19種差異表達的蛋白質。

CFH、CP、TPM4、補體因子 B(complement factor B，CFB)、α1-抗胰糜蛋白酶(alpha-1-antichymotrypsin，ACT)、HP、MAGUK p55 亞家族成員 3(MAGUK p55 subfamily member 3，MPP3)和鋅指蛋白268(zinc finger protein 268，ZNF268)這8種蛋白質在A-B比較及B-D比較中均為B組下調表達，這些蛋白質可能與黏膜炎癥相關，下調表達提示 MH。CK-2e、ALB、APOE、APOA1和 MBD4這5種蛋白質在 A-B比較及B-D比較中均為在B組上調表達，可能與炎癥抑制和黏膜修復相關，上調表達提示MH。此外，SERPINA1和補體C4A在A-B比較中表現為B組下調表達，A2M僅表現為B組較D組上調表達，血清淀粉樣 P成分(serum amyloid P-component，SAP)僅表現為D組較B組上調表達，MAGOH蛋白在A-B比較及A-C比較中均為在A組上調表達，CEP57L1蛋白則不論MH與否均呈現在治療后上調表達。

Figure 3.The networks of proteins differentially expressed between A-B(left)and B-D(right).C4A:complement C4-A;CFB:complement factor B;HP:haptoglobin;CP:ceruloplasmin;HPX:hemopexin;APOA1:apolipoprotein A-I;APOE:apolipoprotein E;ALB:albumin;CFH:complement factor H;SERPINA1:α-1-antitrypsin;APCS:serum amyloid P-component;A2M:α-2-macroglobulin.圖3 A-B、B-D組間差異表達蛋白質的網狀功能圖

從功能網絡圖中可以看到APOA1與周邊蛋白的相互作用，2D-DIGE顯示其表達水平在IFX治療獲得MH組上調;同家族APOE的表達水平也呈現相同趨勢的變化。既往研究報道過兒童CD患者脂蛋白的組成發生變化［7］。Takeuchi等［8］曾對接受IFX治療的類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)患者的研究中發現血清APOA1在治療后上調。近年Serada等［9］運用iTRAQ定量蛋白質組學技術，對自身免疫性疾病患者接受IFX治療前后血清分析發現IFX治療前載脂蛋白家族水平明顯低于治療后12 周，包括 APOE、APOA1、APOA2、APOM 等。Haber man等［10］通過對共359例未接受治療的兒童 CD、UC患者以及健康人的核心基因表達譜及微生物群落比較，發現CD患者2個基因(DUOX2和APOA1)的表達發生了改變。DUOX2上調表達和APOA1下調表達促進氧化應激和Th1細胞極化，腸道黏膜病變更嚴重的患者中變化更顯著。本研究與以上研究結果相符，載脂蛋白表達水平上調可能提示經IFX治療后較輕的疾病狀態。然而，希臘Gazouli等［11］的研究卻顯示原發性無應答或部分應答的CD患者中，APOA1和APOE所對應的蛋白質斑點表達上調，而緩解組中APOA1和APOE無明顯變化。不一致的研究結果可能與納入研究對象的年齡、病程、判斷療效時間點的不同有關。APOE在其它炎癥性疾病的血清中表達亦發生變化［12］，脂類代謝與炎癥反應以及IFX治療效果的關系值得進一步研究。

綜上所述，這項研究采用蛋白質組學技術，發現獲得MH者與未獲得MH者血清蛋白質存在19種蛋白質表達差異，為下一步篩選預測MH的生物標志物奠定了基礎。

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