家蠅幼蟲(chóng)殼聚糖的保鮮及抑菌作用的研究

王　艷，李培森，劉曉芳，徐金瑞（.廣東藥學(xué)院醫(yī)藥化工學(xué)院，廣東中山58458；.廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，廣東廣州50006；3.廣東藥學(xué)院食品學(xué)院，廣東中山58458）

家蠅幼蟲(chóng)殼聚糖的保鮮及抑菌作用的研究

王艷1，李培森2，劉曉芳1，徐金瑞3，*
（1.廣東藥學(xué)院醫(yī)藥化工學(xué)院，廣東中山528458；2.廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，廣東廣州510006；3.廣東藥學(xué)院食品學(xué)院，廣東中山528458）

研究了家蠅幼蟲(chóng)可溶性殼聚糖的抗菌作用和對(duì)楊桃的保鮮效果。從家蠅幼蟲(chóng)提取殼聚糖并降解得到可溶性殼聚糖，設(shè)空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、0.5%殼聚糖組、1%殼聚糖組和2%殼聚糖組，分別測(cè)定其重量，觀察其成熟程度，測(cè)定其維生素C含量和總糖含量。用四種供試菌，采用濾紙片法比較各組的抑菌活性。結(jié)果表明，家蠅幼蟲(chóng)殼聚糖的提取率約為29.70%，木瓜蛋白酶降解可得到可溶性殼聚糖。1%殼聚糖溶液處理明顯降低了楊桃果實(shí)的腐爛程度與失重率，延緩了果實(shí)總糖含量以及VC的降低，提高了楊桃果實(shí)貯藏期間品質(zhì)。其中2%殼聚糖的抑菌效果最好，對(duì)大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌圈分別是（7.821±0.583）、（7.399±0.402）、（6.439±0.405）mm。研究表明家蠅幼蟲(chóng)可溶性殼聚糖不僅有抗菌作用，對(duì)楊桃也有一定的保鮮效果。

家蠅幼蟲(chóng)，可溶性殼聚糖，保鮮，抑菌

楊桃是熱帶、亞熱帶地區(qū)的特產(chǎn)水果，富含維生素C，具有祛風(fēng)熱、生津止渴、止血、拔毒生肌等藥效。但由于楊桃呼吸作用旺盛，果實(shí)皮薄、質(zhì)脆、具棱，因此在貯藏過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分下降快，極易失水皺縮、變味、褐變和損傷腐爛。目前常采用的方法存在毒性殘留、抗藥性成本高及環(huán)境污染問(wèn)題。所以，開(kāi)發(fā)安全無(wú)毒的“綠色”楊桃保鮮劑具有廣闊的市場(chǎng)前景。

殼聚糖是甲殼素在濃堿溶液中脫乙酰基的產(chǎn)物，是自然界的唯一堿性多糖，可溶于稀酸中，因其結(jié)構(gòu)中大量游離氨的存在，使其具有各種優(yōu)良性能而被應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、化妝品、環(huán)保等行業(yè)［1-3］。殼聚糖的保鮮機(jī)理一是其具有良好的成膜性，二是其抑菌活性［4］。目前國(guó)內(nèi)對(duì)殼聚糖的開(kāi)發(fā)主要集中于蝦蟹，但不同種類(lèi)的蝦蟹殼聚糖的含量不同，提取工藝不同，造成了其成本較高，限制了殼聚糖的廣泛使用。家蠅是可再生資源，幼蟲(chóng)殼中的甲殼素含量高達(dá)95%，約是蝦蟹殼的6倍，是潛在的殼聚糖來(lái)源［5］。為此，本文研究了從家蠅幼蟲(chóng)中提取的殼聚糖對(duì)水果的保鮮作用及抑菌作用，為大規(guī)模從蠅蛆中提取利用殼聚糖提供理論依據(jù)。研究可溶性殼聚糖對(duì)楊桃的保鮮及抑菌作用，以期為該殼聚糖應(yīng)用于水果保鮮提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

家蠅幼蟲(chóng)（Musca domestica）由廣東省疾病控制中心提供，經(jīng)繁殖數(shù)代所得；甜楊桃（B10） 2014年10月26日采自廣東省潮州市田間，無(wú)農(nóng)藥，無(wú)保鮮劑，選取成熟度、大小相對(duì)一致、無(wú)機(jī)械損傷的果實(shí)，當(dāng)天運(yùn)達(dá)本校實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理；供試菌種大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、傷寒桿菌，抗生素青霉素、鏈霉素均由廣東藥學(xué)院醫(yī)藥化工學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供；木瓜蛋白酶上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、冰乙酸、無(wú)水乙醇、氯化鈣等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

721型可見(jiàn)光分光光度計(jì)上海精密儀器有限公司；ZHJH-C1209C超凈工作臺(tái)上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；烏氏粘度計(jì)上海華科實(shí)驗(yàn)器材有限公司；ZD-85A恒溫振蕩器江蘇金壇市宏華儀器廠；HPX-9162MBE恒溫培養(yǎng)箱上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1可溶性殼聚糖制備取家蠅幼蟲(chóng)20.0 g研磨后，加入200 mL 2mol·L-1鹽酸溶液離心，攪拌1 h除去灰分，過(guò)濾得家蠅幼蟲(chóng)殼。將家蠅幼蟲(chóng)殼依次浸入2.5 mol·L-1NaOH溶液和1.5 mol·L-1NaOH溶液，沸水浴各4 h除蛋白即得甲殼素粗品。然后60%NaOH溶液沸水浴3 h進(jìn)行脫乙酰基，并用普通濾紙抽濾，洗滌固相殘?jiān)螅苡?0%醋酸溶液攪拌溶解1 h，過(guò)濾，取續(xù)濾液調(diào)其pH=7，出現(xiàn)絮狀沉淀即殼聚糖，離心分離，在80℃下干燥，即得固體殼聚糖［6］。將得到的固體殼聚糖加入到pH4.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，配制成1%的殼聚糖溶液。配制好的殼聚糖溶液置于燒杯中，恒溫水浴中預(yù)熱。溶液升至溫度為40℃后，按照25∶1加入木瓜蛋白酶。反應(yīng)初始時(shí)殼聚糖粘度較高，可用玻璃棒攪拌，使溶液粘度迅速下降。之后將溶液置氣浴恒溫振蕩器中繼續(xù)反應(yīng)約60 min。反應(yīng)結(jié)束后，取殼聚糖降解液加熱煮沸10 min，使溶液中的酶失活，用孔徑為75 μm中速濾紙抽濾，脫去酶。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至一半體積，然后加3倍無(wú)水乙醇進(jìn)行醇沉，靜置過(guò)夜，抽濾，80℃進(jìn)行干燥，即得到可溶性殼聚糖［7］。

1.2.2殼聚糖參數(shù)測(cè)定及對(duì)楊桃的保鮮提取率根據(jù)提取前后的質(zhì)量進(jìn)行計(jì)算。殼聚糖分子量的測(cè)定采用烏氏粘度計(jì)粘度法方法參考賀嵐等［8］，按式（1）計(jì)算特征粘數(shù)［η］：脫乙酰度DD的測(cè)定采用滴定法式（2）計(jì)算［9］。

式中：G樣品溶液的濃度，g/mL；K=0.104×10-3；α=1.12

稱(chēng)取6.0 g家蠅幼蟲(chóng)殼聚糖加入300 mL蒸餾水使之完全溶解即2%殼聚糖，再分別稀釋成1%、0.5%備用。楊桃隨機(jī)分為五組［10-12］：空白對(duì)照組、1%氯化鈣陽(yáng)性對(duì)照組、2%、1%及0.5%蠅蛆殼聚糖，每組20個(gè)。空白對(duì)照組不做如何處理，其他組用對(duì)應(yīng)的溶液浸泡2～3 min后撈出，待其自然風(fēng)干后，裝入0.01 mm PE保鮮袋中，單果包裝于室溫15～25℃，相對(duì)濕度65%～75%下存放。每天記錄其失水率和腐爛率，失水率：用式（3）稱(chēng)重法，9 d后研磨取汁直接滴定法測(cè)定其維生素C含量和總糖含量［13］。

1.2.3殼聚糖的抑菌作用配制2%、1%、0.5%殼聚糖溶液，高壓滅菌后調(diào)至pH=6，同時(shí)生理鹽水作為陰性對(duì)照，抗生素作為陽(yáng)性對(duì)照。將直徑4 mm紙片，121℃高壓滅菌30 min，再經(jīng)80℃烘干，置于干燥器中備用，分別將四種菌懸液0.2 mL均勻涂于L-B肉湯培養(yǎng)基上，均勻涂布制成含菌平板。將紙片置于各溶液中，浸泡40 min，取出待其干燥后貼入含菌平板中，每個(gè)平皿放四片，重復(fù)9次，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24 h。用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法量取抑菌圈直徑（mm）通過(guò)測(cè)定抑菌圈直徑大小評(píng)價(jià)不同組別對(duì)不同受試菌抑制作用［14］。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間差異采用t-檢驗(yàn)，以p＜0.05作為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)，以p＜0.01為差異極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1蠅蛆殼聚糖的參數(shù)

本次實(shí)驗(yàn)所用的干燥家蠅幼蟲(chóng)殼為36.56 g，提取得到的殼聚糖干燥后為10.86 g，提取率約為29.70%，木瓜蛋白酶降解前后的殼聚糖幾乎沒(méi)有損失。實(shí)驗(yàn)滴定所用去的NaOH的體積為15.4 mL，代入式（2）算出脫乙酰度DD值約為62.64%。本次實(shí)驗(yàn)所測(cè)的T0為93 s，T為242 s，G為0.005 g/mL，算出［η］約為6.2547，分子量M約為18497.63163。

2.2殼聚糖對(duì)楊桃保鮮效果

楊桃在儲(chǔ)藏過(guò)程中容易損失水分，呼吸作用旺盛，維生素C被氧化而含量下降，淀粉轉(zhuǎn)化而使總糖含量增多。由表1可知2%、1%及0.5%蠅蛆殼聚糖組的失水率和腐爛程度均比空白對(duì)照組低，維生素C含量和總糖含量與空白對(duì)照組比均有極顯著性差異（p＜0.01），說(shuō)明1%氯化鈣和殼聚糖對(duì)楊桃均有一定的保鮮效果。其中，1%殼聚糖組的失水率最低、腐爛程度最小、維生素C含量最高、總糖含量最低，與陽(yáng)性對(duì)照組相比具有極顯著性差異（p＜0.01），說(shuō)明其對(duì)楊桃的保鮮作用最強(qiáng)。

表1　家蠅幼蟲(chóng)殼聚糖保鮮結(jié)果（x±s，n=20）Table 1　The preservation results of Housefly larvae of chitinous（x±s，n=20）

表2　家蠅幼蟲(chóng)殼聚糖抑菌結(jié)果（以抑菌圈直徑表示，mm，x±s，n=9）Table 2　The antibacterial aesults of Housefly larvae of chitinous（Diameters of inhibition zone，mm，x±s，n=9）

2.3殼聚糖的抑菌結(jié)果

由表2可知，殼聚糖對(duì)大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌作用，對(duì)傷寒桿菌則沒(méi)有抑菌效果。隨著濃度的增加，其抑菌作用也增強(qiáng)。抑菌作用效果依次是：大腸桿菌＞枯草桿菌＞黃色葡萄球菌，但抑菌效果弱于抗生素。

3　結(jié)論

家蠅資源豐富，從中提取殼聚糖工藝較為簡(jiǎn)單統(tǒng)一，既可以變廢為寶，充分利用可再生資源，又可以降低保鮮成本，方便運(yùn)輸。Muzzarelli等認(rèn)為木瓜蛋白酶在微酸條件下可有效降解殼聚糖，降解速度也很高。這種降解方法要求殼聚糖的脫乙酰化度以60%左右為宜。本實(shí)驗(yàn)得到的殼聚糖脫乙酰度為62.64%，適合用木瓜蛋白酶降解，而且條件溫和，無(wú)使用化學(xué)試劑，應(yīng)用在食品行業(yè)較為安全。

家蠅幼蟲(chóng)殼聚糖溶液對(duì)大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌均有一定的抑制效果，可以在一定程度上減少附著的細(xì)菌對(duì)楊桃的損害。1%殼聚糖用來(lái)保鮮楊桃，能夠有效控制微生物數(shù)量，在其表面成膜，阻止其呼吸作用和水分蒸發(fā)，減少腐爛，保持較高維生素C含量，有效延緩成熟。

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Study on preservation and antimicrobial effects by chitosan of Housefly larvae

WANG Yan1，LI Pei-sen2，LIU Xiao-fang1，XU Jin-rui3，*
（1.School of Chemistry and Chemical Engineering，Guangdong Pharmaceutical University，Zhongshan 528458，China；2.School of Basic Courses，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；3.School of Food Science，Guangdong Pharmaceutical University，Zhongshan 528458，China）

The effect of chitosan on the preservation and antibacterial effect of carambola was studied.In this experiment，chitosan of housefly larvae was degradated to get soluble chitosan.The study was divided into five groups：blank group，positive control group，0.5%，1%，2%chitosan group.Every day their weight was measured，their maturity was observed and their content of vitamin C and total sugar after 9 days was measured. Aantibacterial activities of extraction were tested by the filter paper method of four G+and G－strains.It illustrated that the extraction rate of soluble chitosan from housefly larvae was about 29.70%and chitosan could be degradated by papain.This soluble chitosan had certain antibacterial and preservation effect.The concentration of 1%chitosan solution treatment significantly reduces the carambola decay degree and rate of weight loss，delay fruit storage period of soluble solids，total sugar content and vitamin C reduce，improves the quality of carambola during storage.The activity of 2%chitosan group was the strongest，and suppressed zones of Escherichia coli，Bacillus subtilis，Staphylococcus aureus were（7.821±0.583），（7.399±0.402），（6.439± 0.405）mm.The research showed that the soluble chitosan from larva of housefly had good effect on preservation of Carambola and had antibacterial effects

Housefly larvae；chitosan；keep-fresh；antibacterial

TS201.1

A

1002-0306（2015）24-0109-03

10.13386/j.issn1002-0306.2015.24.014

2015－04－17

王艷（1981-），女，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事生物活性物質(zhì)方面的研究，E-mail：sahara81@163.com。

徐金瑞（1976-），女，博士，副教授，主要從事生物活性物質(zhì)與功能食品方面的研究，E-mail：xujr343@126.com。

廣東藥學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院學(xué)科建設(shè)基金；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金（A2014350）。