芹菜素抑制人惡性黑素瘤細胞株增殖及侵襲的研究

韓曉東 孟松樹 程為 孫喆 倪靜 張云飛 林景榮 宋智琦

·論著·

芹菜素抑制人惡性黑素瘤細胞株增殖及侵襲的研究

韓曉東 孟松樹 程為 孫喆 倪靜 張云飛 林景榮 宋智琦

目的 研究芹菜素對惡性黑素瘤體外抑制作用及其分子機制。方法 將人惡性黑素瘤細胞株A375和C8161分為實驗組和對照組，實驗組經不同濃度芹菜素處理一定時間，對照組采用二甲基亞砜處理。采用噻唑藍（MTT）法檢測A375和C8161細胞的增殖，劃痕法檢測細胞遷移。Matrigel侵襲實驗檢測細胞侵襲性，掃描電鏡觀察細胞樹突形態，膜聯蛋白V/碘化丙錠（Annexin-V/PI）法檢測細胞凋亡，PI單染法檢測細胞周期，Western印跡檢測細胞凋亡及細胞外信號調節激酶通路相關蛋白的表達。結果 MTT顯示，芹菜素在10～40 mg/L濃度范圍內對A375和C8161細胞抑制作用呈量效關系，在0～48 h呈時效關系，與對照組相比差異有統計學意義（均P＜0.05）；24 h的半數抑制率（IC50）均為25 mg/L。體外遷移試驗證實，10、20、25 mg/L芹菜素作用于A375和C8161細胞24 h后可明顯抑制細胞遷移（P＜0.01）。體外侵襲實驗證實，10、20、25mg/L芹菜素作用于A375和C8161細胞72 h，細胞侵襲數量顯著少于對照組（P＜0.01）。掃描電鏡示，經25 mg/L芹菜素作用24 h后，A375和C8161細胞樹突均變細長，A375細胞樹突長度為（23.30±2.62）μm，與對照組（12.38±2.27）μm相比差異有統計學意義（P＜0.01）；C8161細胞樹突長度為（16.50±1.62）μm，與對照組（9.36±2.51）μm相比差異亦有統計學意義（P＜0.01）。10、25 mg/L芹菜素處理24 h后，A375細胞凋亡率分別為（3.30±0.82）%、（10.00±0.60）%，與對照組［（0.40±0.07）%、（4.00±0.70）%］相比差異有統計學意義（均P＜0.01）；C8161細胞凋亡率分別為（13.10±1.45）%、（25.77±2.40）%，與對照組（7.27±1.31）%相比差異亦有統計學意義（均P＜0.01）。25 mg/L芹菜素作用于A375和C8161細胞24 h后，細胞周期阻滯于G2/M期，其比例分別為（48.70±3.04）%、（31.10±1.90）%，與對照組［（21.30±0.75）%、（25.06±2.12）%］相比差異有統計學意義（均P＜0.01）。經25 mg/L芹菜素作用24 h后，A375和C8161細胞凋亡相關蛋白活化型半胱天冬酶3（Cleaved caspase-3）和多聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶裂解片段（Cleaved PARP）表達均增加，細胞外信號調節激酶通路均被活化。結論 芹菜素可抑制人惡性黑素瘤細胞增殖、遷移、侵襲，誘導細胞凋亡及周期阻滯，其機制可能與調節ERK信號通路相關蛋白的表達有關。

芹菜素；黑色素瘤，實驗性；細胞增殖；細胞運動；細胞外信號調節MAP激酶類

由于天然藥物或植物來源的藥物具有副作用小、患者耐受性好、可長期應用等優勢，眾多學者致力于該類藥物輔助治療惡性腫瘤的研究。芹菜素是天然存在的黃酮類化合物，是芹菜中的主要生物活性成分，廣泛存在于多種水果、蔬菜、豆類和茶葉中。據研究，芹菜素具有抑制離子型谷氨酸受體N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）的作用［1-2］。近年來關于其抑癌的分子機制亦獲重大發現［3-4］。本研究旨在探討芹菜素抑制惡性黑素瘤（惡黑）細胞增殖、侵襲的作用及其分子機制。

材料與方法

一、材料

細胞系：人黑素瘤A375和C8161細胞株產自中國醫學科學院基礎醫學研究所北京協和醫學院細胞資源中心。芹菜素（編號A0113，CAS登錄號520-36-5，純度≥98%）產自成都曼斯特生物科技有限公司，用二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司）溶解至濃度為40 g/L并于4℃儲存備用。高糖DMEM培養基、胰蛋白酶產自美國Gibco公司，胎牛血清（FBS）產自浙江杭州天杭生物科技有限公司，噻唑藍（MTT）、TritonX-100、N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑MK801產自美國Sigma公司，不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰蛋白酶產自美國Hyclone公司，Matrigel產自美國BD公司，膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）試劑盒產自南京凱基生物科技發展有限公司，碘化丙錠（PI）、核糖核酸酶（RNase）產自日本TaKaRa公司。抗ERK1/2、phospho-Erk1/2兔抗產自美國Promega公司，抗poly ADP-ribose polymerase（PARP）和半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）兔抗產自美國Cell Signaling Technology公司；抗β肌動蛋白鼠抗產自美國Sigma公司。

二、方法

1．細胞培養：A375與C8161細胞均用含10%胎牛血清的DMEM常規37℃、5%CO2培養箱中培養，取對數生長期細胞用于實驗。配制芹菜素原液于20 mg芹菜素中加入500 μl DMSO。

2．MTT法檢測不同藥物對細胞增殖的影響：將A375與C8161細胞（1×104/ml）接種于96孔板，每孔200 μl，每組設3個復孔，實驗組每孔加入芹菜素原液，使其終濃度分別為 10、20、30、40、50、60 70 mg/L，對照組加等量 DMSO，分別于 24、48 、72 96 h加MTT，繼續于培養箱孵育4 h，棄掉培養液加入200 μl DMSO充分振蕩，于490 nm波長處用酶標儀檢測各孔吸光度值（A）。增殖抑制率（%）=（1-實驗組A值/對照組A值）×100%。

3．體外遷移實驗（劃痕法）：將A375與C8161細胞（5 × 105/ml）接種到 24 孔板，每孔 500 μl，于培養箱中孵育24 h，待細胞生長至貼壁率70%～80%后用10 μl槍頭垂直孔板輕輕直線刮除細胞，倒置顯微鏡下觀察，照相。實驗組分別加入含10、20 25 mg/L芹菜素的培養液，對照組加等量DMSO。繼續于培養箱孵育24 h后，倒置顯微鏡下觀察，照相計數各組劃痕部位遷移來的細胞數。

4．體外Matrigel侵襲實驗：用24孔Transwell小室，每組3個復孔。按照說明書方法進行。用DMEM調整A375和C8161細胞濃度至1×106/ml。均取100μl細胞懸液加入小室內，實驗組細胞懸液含濃度為10、20、25mg/L的芹菜素，對照組加等量DMSO，下室按 500 μl/孔加入趨化液（DMEM+10%FBS）。置培養箱中孵育72 h。倒置顯微鏡下觀察穿膜細胞數，光鏡（×200）下隨機選取5個視野（上、下、左、右和中間）照相，計數。

5.掃描電鏡觀察細胞樹突形態變化：將A375與C8161細胞均按2×104/ml接種于6 cm培養皿中，經25 mg/L芹菜素作用24 h，對照組加等量DMSO。PBS沖洗貼壁細胞后用戊二醛固定，PBS沖洗，叔丁醇逐步脫水處理，借助液氮使叔丁醇結晶，氣化，將樣本剪至所需大小及形狀后貼導電膠置于掃描電鏡樣品托上，Quanta200F型掃描電鏡（美國FEI公司）觀察、拍照。

6.Annexin-V FITC/PI雙標記法檢測細胞凋亡率：將A375與C8161細胞以合適密度接種于6cm培養皿，經10、25 mg/L芹菜素作用24 h，對照組加等量DMSO。用不含EDTA的胰酶消化收集處理后的A375細胞，PBS洗滌2次，調整細胞濃度至1×106/ml，用Annexin-V和PI染色，于室溫下避光15 min，流式細胞儀檢測凋亡細胞。

7.PI單染法檢測細胞周期：將A375與C8161細胞以合適密度接種于6 cm培養皿，經10、25 mg/L芹菜素作用24 h，對照組加等量DMSO。用不含EDTA的胰酶消化收集處理后的A375細胞，PBS洗滌，用75%預冷乙醇固定細胞4 h，分別用500 μl配好的染色液［含480 μl PBS、5 μl P（I5 g/L）、5 μl RNase（10g/L）、10μlTritonX100（10%）］重懸，置 37℃30min后流式細胞儀檢測分析周期變化。

8.Western印跡分析：收集經25 mg/L芹菜素或DMSO處理24 h的A375與C8161細胞，加入蛋白裂解液，混勻后冰上裂解30 min，離心后收集上清提取細胞總蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，均取25 μg蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，電轉至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉2 h后，加入相應一抗4℃孵育過夜，第2天洗膜后加人辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，洗膜后用ECL顯色試劑盒作用1 min，后用Bio-Rad凝膠成像系統成像，用儀器自帶軟件Image Lab（version 4.0）分析條帶灰度。實驗用β肌動蛋白做內參照。

結 果

一、芹菜素對細胞增殖的影響

芹菜素對A375和C8161細胞增殖活性的抑制作用在10～40 mg/L濃度范圍0～48 h內呈量效關系（F值分別為 181.96，130.37，均P＜0.001），在 0～48 h內呈時效關系（F值分別為225.14，199.99，均P＜0.001），24 h IC50均為25 mg/L，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）；且芹菜素對A375及C8161細胞的作用劑量與時間均有顯著交互效應（F值分別為 11.989，37.220，P＜0.01），且該交互作用存在濃度及時間限制。見圖1。

二、芹菜素對細胞遷移的影響

芹菜素實驗組A375和C8161細胞向劃痕部位遷移的數量（個）均顯著少于對照組。每視野下A375細胞遷移數量，10 mg/L芹菜素組（3.20±0.84）與20 mg/L組（1.40±0.55）均顯著少于對照組（50.00±1.58），差異有統計學意義（t值分別為 58.50、64.94，均P＜0.001）；C8161細胞遷移數量10 mg/L芹菜素組（11.60±1.52）與 20 mg/L組（3.80±0.84）亦均顯著少于對照組（81.00±9.35），差異有統計學意義（t值分別為16.38、18.38，均P＜ 0.001）。當芹菜素濃度為25 mg/L（IC50），24 h后觀察兩種細胞株遷移情況，劃痕處均未發現遷移細胞。

圖1 不同濃度芹菜素作用不同時間對細胞增殖的抑制作用1A：A375細胞；1B：C8161細胞

圖2 掃描電鏡觀察細胞形態變化 2A、2C：二甲基亞砜對照組；2B、2D：25 mg/L芹菜素處理組

三、芹菜素對細胞侵襲的影響

芹菜素抑制了A375細胞和C8161細胞侵襲。經芹菜素處理24h后，每視野下A375細胞侵襲數量，10 mg/L芹菜素組（53.00±3.61）顯著少于對照組（120.80±7.46），差異有統計學意義（t=18.29，P＜0.01）；C8161細胞侵襲數量10mg/L芹菜素組（3.00±0.71）顯著少于對照組（204.00±13.51），差異有統計學意義（t=33.22，P＜0.01）。當芹菜素濃度增加至≥20mg/L，72h后觀察兩種細胞株侵襲情況，均未發現穿膜細胞。

四、芹菜素對細胞形態的影響

掃描電鏡結果，經25 mg/L芹菜素處理24 h后，A375與C8161細胞形態均發生變化，主要表現為細胞樹突變細變長（圖2）。A375細胞樹突長度在25 mg/L芹菜素組為（23.30±2.62）μm，與對照組（12.38±2.27）μm相比差異有統計學意義（P＜0.01）；C8161細胞樹突長度在25 mg/L芹菜素組為（16.50±1.62）μm，與對照組（9.36±2.51）μm 相比差異有統計學意義（P＜0.01）。

五、芹菜素對細胞凋亡的影響

10、25 mg/L芹菜素處理24 h后，A375細胞凋亡率分別為（3.30±0.82）%與（10.00±0.60）%，與對照組［（0.40±0.07）% 和（4.00±0.70）%］相比差異有統計學意義（t值分別為 6.11，11.27，均P＜0.01）；C8161細胞凋亡率分別為（13.10±1.45）%與（25.77±2.40）%，與對照組（7.27±1.31）%相比差異有統計學意義（t值分別為 5.17，11.73，均P＜ 0.01）。

表1 25 mg/L芹菜素對A375和C8161細胞周期的影響（±s）

表1 25 mg/L芹菜素對A375和C8161細胞周期的影響（±s）

注：n=3。25 mg/L芹菜素組誘導了A375和C8161細胞G2/M期阻滯，與對照組相比，P＜0.05

A375 C8161 G0/G1（%） G2/M（%） G0/G1（%） G2/M（%）對照組 51.80±3.29 21.30±0.75 45.37±2.61 25.06±2.12 25mg/L芹菜素 32.30±2.86 48.70±3.04 44.63±3.23 31.10±1.90 t值 7.74 15.13 0.31 3.63 P值 0.01 ＜0.001 ＞0.05 ＜0.01組別

六、芹菜素對細胞周期的影響

25 mg/L芹菜素處理24 h后，可誘導A375細胞和C8161細胞周期阻滯在G2/M期。G2/M期A375細胞和C8161細胞比例在芹菜素組與對照組間差異有統計學意義（均P＜0.05），G0/G1細胞比例在芹菜素組低于對照組。見表1。

七、芹菜素對caspase-3、PARP及總ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達的影響

圖3 Western印跡檢測凋亡相關蛋白caspase-3、PARP及總ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達的影響 3A：A375細胞株；3B：C8161細胞株。PARP：多聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶；Cleaved PARP：多聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶裂解片段；caspase-3：半胱氨酸蛋白酶-3 Cleaved caspase-3：活化型半胱天冬酶-3和（Cleaved PARP）；ERK1/2絲裂原活化蛋白激酶1/2；p-ERK1/2：磷酸化絲裂原活化蛋白激酶1/2。1：二甲基亞砜；2：25 mg/L 芹菜素

Western印跡結果示，經25 mg/L芹菜素作用后A375細胞（圖 3A）及 C8161細胞（圖 3B）Cleaved caspase-3、Cleaved PARP蛋白表達均較對照組明顯增加，而p-ERK1/2蛋白表達下調，總ERK1/2表達不變 （圖 3）。當設置組 Cleaved PARP、Cleaved caspase-3、p-ERK的A值為1.00時，其在芹菜素處理組A375細胞中的相對A值分別為（2.72±0.17）、（25.00±2.60）、（0.86±0.08）；C8161細胞中A值分別為 （2.26 ± 0.14）、（2.55 ± 0.19）、（0.84 ± 0.09），與對照組相比差異有統計學意義（均P＜0.05）。

討 論

有研究發現，芹菜素能夠降低cyclin B的表達及Cdc2的磷酸化并使細胞周期阻滯在G2-M期，從而有效地抑制胰腺癌細胞的增殖［5］；并且可通過抑制p34（cdc2）激酶，降低p34與cyclin B1蛋白蓄積導致人結腸癌細胞的細胞周期阻滯于G2/M期［6］。另有報告芹菜素能夠下調乳腺癌SK-BR-3細胞中的CDK1、cyclin A及cyclin B的表達，上調CDK抑制因子p21cip1表達，使SK-BR-3細胞周期阻滯于G2-M期［7］。對分別表達野生型p53和視網膜母細胞瘤腫瘤抑制蛋白（Rb）的乳腺癌細胞株MCF-7，以及p53突變與Rb陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-468進行研究，發現芹菜素能夠抑制細胞增殖、誘導細胞G2/M期阻滯，同時伴隨著cyclin B1和CDK1蛋白水平的明顯下降，致使CDK1激酶活力明顯抑制；進一步研究發現，芹菜素抑制Rb磷酸化，但不影響cyclin E、CDK2 以及 CDK6 的蛋白水平［8］。在對突變型p53人結腸癌細胞株HT-29和人骨肉瘤細胞株MG63研究中發現，芹菜素可顯著上調p21/WAF1蛋白表達，抑制細胞增殖、導致G2/M期阻滯，且呈量效與時效關系。提示芹菜素上調p21/WAF1蛋白表達及抑制細胞增殖不依賴p53途徑［9］。本研究亦發現芹菜素可誘導黑素瘤A375細胞及C8161細胞周期明顯阻滯于G2/M期，因此，有必要對其具體機制進行深入研究。

促進腫瘤細胞凋亡是抗腫瘤藥物的主要作用機制。有報告芹菜素可通過改變Bax/Bcl-2比例促進細胞凋亡，這與細胞色素C的釋放以及凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）的誘導作用有關，并且導致caspase-3、caspase-9和多聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（PARP）裂解片段的產生［10］。有研究發現，芹菜素可通過促進p53的表達，經轉錄依賴性與非依賴性途徑誘導細胞凋亡；且細胞的生存率隨著芹菜素濃度的增加及作用時間的延長而逐漸降低［11］。本研究結果表明，芹菜素可誘導惡黑細胞凋亡，抑制惡黑ERK信號通路活化。

我們前期研究發現，谷氨酸受體拮抗劑MK-801及CPCCOEt可導致人惡黑細胞株WM451細胞樹突變細長，其形態接近正常黑素細胞，并且可使細胞骨架蛋白重組、從而抑制WM451細胞的侵襲、遷移［12-14］。本研究表明，芹菜素亦可改變惡黑細胞的樹突形態，使樹突由短粗的近三角形變為長梭狀或細樹枝狀。推測，芹菜素通過阻斷谷氨酸信號通路，導致細胞骨架蛋白的重組及腫瘤細胞分化，從而影響腫瘤細胞的遷移與侵襲。

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Inhibitory effect of apigenin on proliferation and invasion of human malignant melanoma cells

Han Xiaodong*,Meng Songshu,Cheng Wei,Sun Zhe,Ni Jing,Zhang Yunfei,Lin Jingrong,Song Zhiqi.*Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Dalian Medical University,Dalian 116011,China

ObjectiveTo evaluate the inhibitory effect of apigenin on malignant melanomain vitro,and to investigate its mechanisms.MethodsHuman malignant melanoma cell lines A375 and C8161 were divided into test groups and control group separately.Cells in the test groups were treated with apigenin at different concentrations,while cells in the control group were treated with dimethyl sulfoxide,for different durations.Subsequently,methyl thiazolyl tetrazolium （MTT）assay,wound healing assay and Matrigel invasion assay were carried out to estimate cellular proliferative activity,migratory activity and invasive activity,respectively,and scanning electron microscopy（SEM）was used to observe morphology of melanocyte dendrites.Flow cytometry using annexin-V/propidium iodide （PI）staining was performed to detect cell apoptosis,propidium iodide（PI）staining to analyze cell cycle,and Western blot to measure the expressions of proteins related to apoptosis and involved in the extracellular signal-regulated kinase（ERK）signaling pathway.ResultsMTT assay showed significant differences in cellular proliferative activity between the test groups and control group （allP＜0.05）.The proliferation of A375 and C8161 cells was inhibited by apigenin in a dosedependent manner when the concentration of apigenin was 10-40 mg/L,and in a time-dependent manner when the treatment duration varied from 0 to 48 hours.The half-maximal inhibitory concentration （IC50）of apigenin at 24 hourswas 25 mg/L for both A375 and C8161 cells.Wound healing assay showed that the migration of A375 and C8161 cells was significantly decelerated after 24-hour treatment with apigenin of 10,20 and 25 mg/L compared with the control cells（allP＜0.01）.Matrigel invasion assay demonstrated that the number of invasive cells was significantly smaller in A375 and C8161 cells treated with apigenin of 10,20 and 25 mg/L for 72 hours than in the control cells（allP＜0.01）.SEM showed that the dendrits of both A375 and C8161 cells became thinner and longer after treatment with 25 mg/L apigenin for 24 hours,with the length of dendrits being（23.30±2.62）μm and（16.50±1.62）μm respectively,compared to（12.38±2.27）μm and （9.36±2.51）μm respectively in the control groups（bothP＜0.01）.After treatment with apigenin of 10 and 25 mg/L for 24 hours,a significant increase was observed in apoptosis rate in both A375 cells（3.30%±0.82%vs.0.40%±0.07%,P＜0.01;10.00%±0.60%vs.4.00%±0.70%,P＜0.01）and C8161 cells（13.10%±1.45%vs.7.27%±1.31%;25.77%±2.40%vs.7.27% ±1.31%;bothP＜0.01）compared with the control cells.Both A375 and C8161 cells were arrested in G2/M phase after treatment with 25 mg/L apigenin for 24 hours,with the percentage of cells in G2/M phase being 48.70%±3.04%and 31.10%±1.90%respectively,compared to 21.30%±0.75%and 25.06%±2.12%respectively in the control groups（bothP＜0.01）.Western blot showed an increase in the expressions of apoptosis-related proteins including cleaved caspase-3 and cleaved poly ADP-ribose polymerase（PARP）with the activation of ERK signaling pathway in both A375 and C8161 cells after 24-hour treatment with 25 mg/L apigenin compared with the control groups.Conclusions Apigenin can inhibit the proliferation,migration and invasion of,but induce apoptosis and cell cycle arrest in human malignant melanoma cells,likely by regulating the expression of ERK signaling pathway-related proteins.

Apigenin;Melanoma,experimental;Cell proliferation;Cell movement;Extracellular signalregulated MAP kinases

Song Zhiqi,Email:szqdalian@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.02.015

國家自然科學基金（81472865、81171491）；遼寧省自然科學基金（201102056）

116011大連醫科大學附屬第一醫院皮膚科（韓曉東、孫喆、倪靜、張云飛、林景榮、宋智琦）;大連醫科大學腫瘤干細胞研究院（孟松樹、程為）

宋智琦，Email：szqdalian@163.com

2014-02-13）

（本文編輯：尚淑賢）