左旋多巴對馬爾尼菲青霉黑素合成以及藥敏的影響

彭程 孫弦 劉棟華

·論著·

左旋多巴對馬爾尼菲青霉黑素合成以及藥敏的影響

彭程 孫弦 劉棟華

目的 探討左旋多巴對馬爾尼菲青霉黑素合成的影響及黑素化是否影響馬爾尼菲青霉對抗真菌藥的敏感性。方法 將馬爾尼菲青霉臨床分離株GXMU121011分別接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基37℃培養7 d，觀察左旋多巴不同濃度（0.1～10.0 mmol/L）和馬爾尼菲青霉不同接種密度（1.0×105～1.0×107cfu/ml）對馬爾尼菲青霉黑素生成的影響。用紙片法進行體外抗真菌藥敏試驗，分別測定伊曲康唑、氟康唑和兩性霉素B對8株馬爾尼菲青霉菌株在含左旋多巴和不含左旋多巴培養時的抑菌圈大小。結果 左旋多巴濃度由0.1 mmol/L增加至1.0 mmol/L時，馬爾尼菲青霉菌落變黑程度隨之增加；左旋多巴濃度處在1.0 mmol/L或3.0 mmol/L時，菌落最黑，左旋多巴濃度繼續增加時菌落黑化程度減輕，左旋多巴濃度在10.0 mmol/L時菌體出現輕微皺縮的現象。菌落顏色隨著接種菌密度的逐漸升高而加深。伊曲康唑、兩性霉素B和氟康唑對含左旋多巴培養的馬爾尼菲青霉抑菌圈平均直徑均顯著小于不含左旋多巴培養的馬爾尼菲青霉（P＜0.05）。結論 左旋多巴的濃度和接種菌落的密度影響馬爾尼菲青霉黑素的生成。黑素化培養可以降低酵母相馬爾尼菲青霉對伊曲康唑、氟康唑和兩性霉素B的敏感性。

馬爾尼菲青霉；黑素；左旋多巴；抗真菌藥

馬爾尼菲青霉（Penicillium marneffei，PM）是青霉菌屬中唯一具有溫度雙態性的真菌，25℃呈菌絲相生長，37℃呈酵母相生長，酵母相為致病相。馬爾尼菲青霉病（penicilliosis marneffei，PSM）是由PM感染引起的一種少見深部真菌病，本病可為局限性感染，更多為播散性感染；多發生于有免疫功能缺陷者，也有報道發生于免疫功能正常者［1］。黑素是一類廣泛存在于植物、動物以及微生物中的深褐色至黑色大分子化合物，研究發現，多種致病性真菌，如，煙曲霉、申克孢子絲菌等產生的黑素能增強真菌的毒力，其機制包括抗氧化、抗溶酶體、耐受抗真菌類藥物等［2］。本課題組前期［3］研究證實，PM 在體外可以利用左旋多巴合成黑素。2005年，Youngchim等［4］證實，體外PM可以合成黑素或黑素樣化合物，使用抗煙曲霉黑素的抗體可以檢測到感染PM的小鼠血清中以及1例患者皮損組織中有黑素，研究結果提示，PM在人體內可以利用左旋多巴或L酪氨酸等底物合成黑素，從而增強其自身逃避宿主免疫殺傷的能力，但其確切的性質及機制尚不明確。本實驗通過培養觀察不同濃度的左旋多巴和不同接種菌落密度對PM黑素生成的影響，使用紙片法進行體外抗真菌藥敏試驗，探討黑素化對PM抗真菌藥物的敏感性是否有影響。

資料與方法

一、材料

1.菌株來源：馬爾尼菲青霉菌株8株，其中1株馬爾尼菲青霉標準株FRR2161（澳大利亞墨爾本大學AlexAndromopolous教授惠贈）；其余7株臨床患者分離株（GXMU08018、GXMU121011、GXMU130122、GXMU110601、GXMU10844、GXMU111230、GXMU 080122）系廣西醫科大學第一附屬醫院皮膚性病科真菌室保存；實驗質控菌株采用近平滑念珠菌（ATCC22019）。

2.主要試劑和儀器：左旋多巴購于美國Sigma公司，天門冬酰胺購于上海生工生物工程技術服務有限公司，瓊脂粉、葡萄糖購于上?；瘜W試劑公司，蛋白胨購于英國Oxoid公司，真菌藥敏片購于溫州市康泰生物科技有限公司。

二、方法

1.不同濃度的左旋多巴對PM產黑素的影響①配制含不同左旋多巴濃度的沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）平皿，依次為 0.1、1.0、3.0、6.0、10.0 mmol/L設空白對照組不加左旋多巴；②將PM臨床分離株GXMU121011酵母相細胞菌懸液接種于平皿中③倒扣平皿，置于37℃恒溫箱避光培養7 d，觀察菌落顏色的變化。

2.左旋多巴濃度一定時不同菌接種密度對PM產黑素的影響：①制備含1.0 mmol/L左旋多巴的SDA平皿，設空白對照組不加左旋多巴；②將PM臨床分離株GXMU121011酵母相細胞菌懸液用血細胞計數板計數，調整密度分別為1.0×105、1.0×1061.0×107cfu/ml；③分別吸取各濃度菌懸液200 μl于平皿中；④用無菌涂布棒涂勻；⑤37℃溫箱倒置避光培養7 d，觀察菌落顏色。

3.黑素化后的PM體外藥敏試驗：①真菌藥敏紙片的準備：伊曲康唑 8 μg，氟康唑 15 μg，兩性霉素B10 μg；②制備含1.0 mmol/L左旋多巴的SDA平皿為實驗組；不含左旋多巴的SDA平皿為對照組；③將PM酵母細胞菌懸液調至1.0個麥氏濃度④用無菌棉拭子蘸取適量上層液體，均勻涂布在培養基表面；⑤待平皿上的水分被瓊脂完全吸收后用無菌眼科鑷子取藥敏紙片貼上；⑥37℃培養48～96 h，測量并記錄抑菌圈直徑。

圖1 馬爾尼菲青霉（GXMU121011）在含不同濃度左旋多巴的SDA生長7 d，可見不含左旋多巴培養的菌落呈淡黃色；左旋多巴濃度由0.1 mmol/L增至1.0 mmol/L時，PM菌落變黑程度隨之增加；左旋多巴濃度在1.0 mmol/L或3.0 mmol/L時菌落最黑，而左旋多巴濃度由3.0 mmol/L增至10.0 mmol/L時菌落顏色逐漸變淺

圖2 不同馬爾尼菲青霉（GXMU121011）接種密度在含/不含1.0 mmol/L左旋多巴的SDA生長7 d，接種密度由1.0×105cfu/ml增至1.0×107cfu/ml，含左旋多巴培養的菌落顏色逐漸加深（圖2上排），不含左旋多巴（圖2下排）顏色無明顯改變

4.統計方法：所測得的結果經過統計軟件SPSS 16.0進行分析，采用配對t檢驗比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、不同濃度左旋多巴對PM產黑素的影響

左旋多巴濃度由0.1 mmol/L增加至1.0 mmol/L時，PM菌落變黑程度隨之增加；左旋多巴濃度在1.0 mmol/L或3.0 mmol/L時，菌落最黑，左旋多巴濃度繼續增加時菌落黑化程度減輕，左旋多巴濃度在10.0 mmol/L時菌體出現輕微皺縮的現象，見圖1。

二、接種菌密度對PM產黑素的影響

PM在含1.0 mmol/L左旋多巴的SDA培養，菌落顏色隨著接種菌密度的逐漸升高而加深，對照組（即不含左旋多巴培養）顏色無明顯改變（圖2）。

三、體外藥敏試驗結果

8株PM菌株在含/不含1.0 mmol/L左旋多巴的SDA平皿中37℃培養，48～96 h后測得伊曲康唑，氟康唑和兩性霉素B對PM抑菌圈平均直徑依次為：伊曲康唑26.88 mm±1.81 mm（對照組34.13 mm±1.81 mm）；氟康唑19.50 mm±6.46 mm（對照組25.87mm±7.34mm）；兩性霉素B，17.13mm±2.59mm（對照組22.25 mm±4.80 mm）；含左旋多巴和不含左旋多巴培養（即對照組）兩組比較差異均有統計學意義（t值依次為 13.781，8.728，4.163，均 P ＜0.05）。3種抗真菌藥質控結果均在質控范圍內，伊曲康唑24 mm（不含左旋多巴28 mm）；氟康唑36 mm（不含左旋多巴38 mm）；兩性霉素B 25 mm（不含左旋多巴20 mm）。

討 論

本課題前期［3］研究用含或不含1.0 mmol/L左旋多巴的基礎培養基和腦心浸膏培養基培養酵母相PM，透射電鏡觀察其細胞壁內側面有密集排列的電子致密顆粒，直徑約100 nm，分離菌體色素顆粒經電子自旋共振等方法證實PM在體外能利用左旋多巴合成黑素［5］。新生隱球菌［6］、巴西副球孢子菌［7］等相關文獻是用1.0 mmol/L左旋多巴進行黑素化誘導，酵母相PM黑素化最適合的左旋多巴濃度待確定。本研究實驗結果提示，最適合誘導PM合成黑素濃度為1.0～3.0 mmol/L，左旋多巴繼續增加時PM黑素產生并不增加，菌落生長可能還受到抑制。因此，藥敏試驗中，我們采用左旋多巴濃度為1.0 mmol/L作為誘導PM黑素化培養。用含同樣濃度左旋多巴的培養基，接種菌密度越大菌落顏色越深，黑化程度增高，其機制可能為微生物的群體感應效應，這在新生隱球菌有同樣的現象［8］。通常PM在25℃產生紅色素，而37℃不產生紅色素而成白色菌落，同時PM細胞的形態還與培養基的成分相關，本研究采用SDA，37℃PM在SDA上生長，PM細胞并不完全表現為酵母樣細胞，少部分為短棒狀菌絲體，在37℃SDA培養部分菌落產生少許紅色素，此現象主要出現在低密度（1.0×105cfu/ml）接種，較高密度接種（1.0×107cfu/ml）的菌落無此現象，提示PM在形成酵母細胞的生長過程中同樣存在著群體感應效應。

黑素作為真菌毒力因子之一，其作用主要體現在增強病原體抵抗宿主氧化殺傷方面，黑素對病原體抵抗抗真菌藥物是否有影響？van Duin等［9］報道用大量肉湯稀釋法檢測新生隱球菌和莢膜組織胞漿菌對抗真菌藥的敏感性，結果為黑素化和未黑素化的兩種菌對兩性霉素B、卡泊芬凈、氟康唑、伊曲康唑和氟胞嘧啶差異均無統計學意義，而用時間殺菌實驗方法檢測結果為黑素化的這兩種菌株在兩性霉素B、卡泊芬凈敏感性比未黑素化的有減弱，但在氟康唑、伊曲康唑和氟胞嘧啶沒有差異。de Fatima Lisboa Fernandes 等用微量肉湯稀釋法［6］，Ikeda等［10］用微量肉湯稀釋法和時間殺菌實驗檢測新生隱球菌對兩性霉素B和伏立康唑的敏感性，結果為黑素化比未黑素化的新生隱球菌對兩性霉素B敏感性減弱，而對伏立康唑無差異。本研究用伊曲康唑，氟康唑和兩性霉素B 3種抗真菌藥物紙片擴散法行體外藥敏試驗，黑素化比非黑素化平皿的抑菌圈直徑均減少，差異有統計學意義（P＜0.05），提示黑素化的PM對以上3種抗真菌藥的敏感性下降，與上述文獻報道的不完全一致，考慮實驗方法、菌種、菌株對藥敏試驗有影響。研究發現，新生隱球菌的黑素沉積在細胞壁，兩性霉素B和卡泊芬凈與黑素預孵化后，黑素C：N：O比例發生了變化，提示黑素與AMB和卡泊芬凈結合，阻止AMB到達作用部位，但是唑類抗真菌藥黑素C：N：O比例沒有變化［10-11］。兩性霉素B直接與敏感真菌細胞膜上的麥角甾醇結合，損傷膜的通透性；唑類抗真菌藥與真菌細胞色素P450發生交互作用，阻斷去甲基化過程，間接抑制真菌細胞膜麥角固醇的生物合成。我們推測PM黑素能夠增強細胞壁穩定性，減弱抗真菌藥進入細胞膜及細胞質，從而降低對抗真菌藥物的敏感性。在新生隱球菌感染小鼠模型試驗中，除草劑glyphosphate能降低新生隱球菌黑素水平并延長小鼠生存時間［12］，提示在臨床治療中可以在使用抗真菌藥的基礎上聯合抑制PM黑素形成的藥物可能會增加PM對抗真菌藥的敏感性。

［1］蘇小芬,張挪富,劉春麗,等.免疫健全者播散性馬爾尼菲青霉菌病一例及文獻復習［J］.中國呼吸與危重監護雜志,2013,（3）:244-248.

［2］張曉利,呂雪蓮,劉維達.黑素及其對真菌毒力的影響［J］.國際皮膚性病學雜志,2008,34（6）:397-399.

［3］郭婷,梁伶,劉棟華,等.馬爾尼菲青霉酵母細胞黑素的分離純化及理化性質的分析［J］.中華皮膚科雜志,2013,46（5）:345-348.

［4］Youngchim S,Hay RJ,Hamilton AJ.Melanization ofPenicillium marneffei in vitroandin vivo ［J］.Microbiology,2005,151（1）:291-299.

［5］Liu D,Wei L,Guo T,et al.Detection of DOPA-melanin in the dimorphic fungal pathogenPenicillium marneffeiand its effect on macrophage phagocytosisin vitro ［J］.PLoS One,2014,9（3）:e92610.

［6］de Fatima Lisboa Fernandes O,Costa CR,de Souza Lino Junior R,et al.Effects of Pimenta pseudocaryophyllus （Gomes） L.R.Landrum, on melanized and non-melanized Cryptococcus neoformans［J］.Mycopathologia,2012,174（5-6）:421-428.

［7］Uran ME,Nosanchuk JD,Restrepo A,et al.Detection of antibodies againstParacoccidioides brasiliensismelanin inin vitroandin vivo studies during infection［J］.Clin Vaccine Immunol,2011,18（10）:1680-1688.

［8］Eisenman HC,Chow SK,Tse KK,et al.The effect of L-DOPA on Cryptococcus neoformans growth and gene expression ［J］.Virulence,2011,2（4）:329-336.

［9］van Duin D,Casadevall A,Nosanchuk JD.Melanization of Cryptococcus neoformansandHistoplasma capsulatumreduces their susceptibilities to amphotericin B and caspofungin［J］.Antimicrob Agents Chemother,2002,46（11）:3394-3400

［10］Ikeda R,Sugita T,Jacobson ES,et al.Effects of melanin upon susceptibility ofCryptococcusto antifungals ［J］.Microbiol Immunol,2003,47（4）:271-277.

［11］Nosanchuk JD,Casadevall A.Impact of melanin on microbial virulence and clinical resistance to antimicrobial compounds［J］.Antimicrob Agents Chemother,2006,50（11）:3519-3528.

［12］Nosanchuk JD,Ovalle R,Casadevall A.Glyphosate inhibits melanization ofCryptococcus neoformansand prolongs survival of mice after systemic infection［J］.J Infect Dis,2001,183（7）:1093-1099.

Effect of levodopa on melanogenesis in and antifungal drug susceptibility ofPenicillium marneffei

Peng Cheng,Sun Xian,Liu Donghua.Department of Dermatology and Venereology,First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China

ObjectiveTo investigate the effectoflevodopa onmelanogenesisinPenicillium marneffei（PM）,and to determine if melanization affects the antifungal drug susceptibility of PM.MethodsA clinical isolate of PM,GXMU121011,wasinoculatedontoSabouraud′sdextroseagar（SDA）containingdifferentconcentrations（0.1-10mmol/L）of levodopa at an inoculum density of 1.0×106cfu/ml,or onto SDA containing 1 mmol/L levodopa at three inoculum densities（1.0×105,1.0×106,1.0×107cfu/ml）,and cultured at 37℃for 7 days.Subsequently,melanization of PM colonies was observed.The paper-disk method was used for antifungal susceptibility testing,and the diameter of inhibition zones of itraconazole,fluconazole and amphotericin B against 8 clinical strains of PM was determined on SDA with or without levodopa.ResultsThe melanization of PM colonies increased when the concentration of levodopa increased from 0.1 to 1.0 mmol/L,peaked when that reached 1.0 and 3.0 mmol/L,but mildly decreased when that continuously increased beyond 3.0 mmol/L,and a slight shrinkage was observed in PM colonies when that was 10.0 mmol/L.The color of colonies deepened along with the increase in inoculum density of PM.The average diameters of inhibition zones of itraconazole,fluconazole and amphotericin B against PM were all significantly lower on SDA with levodopa than on SDA without levodopa（allP＜0.05）.Conclusions Levodopa concentration and inoculum density both affect melanogenesis in PM.Melanization may decrease the susceptibility of PM in yeast phase to itraconazole,fluconazole and amphotericin Bin vitro.

Penicillium marneffei;Melanins;Levodopa;Antifungal agents

Liu Donghua,Email:ldhgxmu@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.02.014

國家自然科學基金（81160191）

530021南寧，廣西醫科大學第一附屬醫院皮膚性病科

劉棟華，Email：ldhgxmu@163.com

2014-03-30）

（本文編輯：吳曉初）