β聯蛋白對過氧化氫誘導人皮膚成纖維細胞增殖活性及凋亡相關基因Bcl-2、Bax表達的影響

田黎明 謝紅付 李吉 楊婷 彭圓 胡威

·論著·

β聯蛋白對過氧化氫誘導人皮膚成纖維細胞增殖活性及凋亡相關基因Bcl-2、Bax表達的影響

田黎明 謝紅付 李吉 楊婷 彭圓 胡威

目的 觀察高表達的β聯蛋白對過氧化氫（H2O2）誘導衰老人皮膚成纖維細胞（HSF）增殖活性以及凋亡相關基因Bcl-2、Bax表達的影響。方法 實驗分3組。HSF細胞分別轉染pcDNA3.1-β聯蛋白或空載體pcDNA3.1，然后150 μmol/L H2O2處理2 h。噻唑藍檢測細胞增殖活性，流式細胞儀檢測細胞凋亡水平，RTPCR和Western印跡分析凋亡相關基因Bcl-2、Bax的表達。結果 HSF+空載體組、HSF+空載體+H2O2組、HSF+β聯蛋白+H2O2組細胞增殖活性分別為0.792±0.012、0.462±0.012、0.521±0.015，細胞凋亡率分別為（3.407±0.217）%、（24.555±1.793）%、（15.360±0.755）%，各組比較，差異有統計學意義（均P＜0.01）。HSF+空載體+H2O2組Bcl-2 mRNA和蛋白水平（與GAPDH mRNA和蛋白的比值分別為0.333±0.003和0.336±0.004）明顯低于HSF+空載體組（分別為0.507±0.013和0.514±0.021），兩組比較，均P＜0.01。HSF+β聯蛋白+H2O2組Bcl-2 mRNA和蛋白水平分別為0.404±0.006和0.411±0.005明顯高于HSF+空載體+H2O2組，兩組比較，均P＜0.01。HSF+空載體+H2O2組Bax mRNA和蛋白水平（與GAPDH mRNA和蛋白的比值分別為0.451±0.002和0.460±0.008）明顯高于HSF+空載體組，兩組比較，均P＜0.01。HSF+β聯蛋白+H2O2組Bax mRNA和蛋白水平（分別為0.339±0.012和0.346±0.013）明顯低于HSF+空載體+H2O2組，兩組比較，均P＜0.01。結論 高表達的β聯蛋白能夠提高衰老人皮膚成纖維細胞增殖活性。

成纖維細胞；細胞衰老；β聯蛋白；細胞凋亡；基因，Bcl-2；基因，Bax

β聯蛋白（β-catenin）是經典的Wnt信號通路的下游效應器。研究發現，β聯蛋白在調控細胞增殖、分化、凋亡和衰老方面有著重要的作用［1-3］。本課題前期［4］實驗發現，β 聯蛋白在過氧化氫（H2O2）所致的人皮膚成纖維細胞（HSF）衰老中的表達明顯下調；β聯蛋白能夠抑制細胞衰老相關β-半乳糖甘酶（SA-β-gal）和細胞活性氧（ROS）的表達，同時上調SOD的活性［5］，推測β聯蛋白可能具有抗細胞衰老的作用。我們進一步研究高表達的β聯蛋白對H2O2所致衰老的HSF增殖活性以及凋亡相關基因B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關 x蛋白（Bax）表達的影響，探討β聯蛋白對衰老成纖維細胞增殖活性和凋亡相關基因的調節作用。

資料與方法

一、資料

T-Gradient Thermoblock PCR儀產自德國Denver公司，凝膠影像分析系統Jeldoc 2000型產自美國BioRad公司，Synergy H4全功能酶標儀產自美國BioTek公司，流式細胞儀產自德國Miltenyi Biotec GmbH公司，抗Bcl-2單抗、抗bax單抗、抗GAPDH單抗產自美國Santa Cruz生物公司。

二、方法

1.HSF分離與培養［4］：小兒包皮獲得HSF，DMEM培養基加10%胎牛血清（FBS）培養，細胞長至80%融合后0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）1∶1消化傳代擴增，取2～4代HSF用于試驗。

2.細胞轉染：實驗方法參考文獻［5］。

3.H2O2處理HSF誘導衰老模型：實驗方法參考文獻［5］。

4.實驗分組：轉空載體組（HSF+空載體）、轉空載體H2O2處理組（HSF+空載體+H2O2）以及轉β聯蛋白H2O2處理組（HSF+β聯蛋白+H2O2）。

5.噻唑藍（MTT）測定細胞增殖活性：轉染前后的HSF細胞融合度達80%時，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，1640培養液制成單細胞懸液，接種于96孔板，各實驗組在5%CO2，37℃條件下培養，當細胞融合達70%以上時，進行實驗。對照組未經H2O2處理。然后每孔加入MTT 溶液（5 g/L）20 μl，37℃繼續培養4 h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min，使結晶充分溶解。用Synergy H4全功能酶標儀，波長在570 nm處，測定各孔的吸光度（A值），以示細胞增殖活性情況。以上實驗重復3次。

6.細胞凋亡的檢測：培養24 h后收集轉染前后各組細胞，4℃PBS洗滌細胞2次，棄上清，加結合緩沖液調整細胞密度為1×106/ml，取100 μl細胞懸液到5 ml管中，每管加Annexin V FITC和PI各5 μl混勻，室溫避光 5 min，加 400 μl結合緩沖液，0.5 h 內行流式細胞儀檢測。以上實驗重復3次，取平均值。

7.RT-PCR檢測HSF中Bcl-2、Bax mRNA的表達：Trizol抽提細胞總RNA，RT-PCR分別檢測Bcl-2 Bax在各實驗組HSF中mRNA的表達。根據在線引物設計軟件（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）設計的Bcl-2 基因，正向引物：5′-GCCTCTGTTTGATTTCTCC T-3′；反向引物：5′-TCACTTGTGGCCCAGATAGG-3′Bax基因，正向引物：5′-CTGAGCAGATCATGAAGAC A-3′；反向引物：5′-CTCTGCAGCTCCATGTTACT-3′內參磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）基因，正向引物5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′；反向引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。PCR反應體系和PCR反應條件參考文獻［4］。用凝膠分析系統掃描拍照檢測各電泳條帶的灰度值（Bcl-2/GAPDH比值、Bax/GAPDH比值），得到Bcl-2、BaxmRNA的相對含量。

8.Western印跡檢測HSF中Bcl-2、Bax蛋白的水平：Western印跡方法參照文獻 ［4］。在冰上用PIPA溶解細胞，旋轉使細胞充分破碎，離心后的上清分裝到0.5 ml離心管中，測蛋白濃度或放于-70℃保存。取蛋白樣品加入5×變性上樣緩沖液，100 V電壓跑膠，轉PVDF膜，室溫振蕩封閉1 h。加入一抗（Bcl-2 1 ∶200或 Bax 1∶200；GAPDH 1 ∶3 000）4℃過夜，TTBS洗膜，10 min×3次，加入二抗（HRP 1∶10 000），室溫振蕩孵育1 h。在PVDF膜上均勻的涂抹化學發光底物，保持2 min。采用凝膠成像分析軟件分析，記錄每條蛋白電泳帶的灰度值。

9.統計分析：所有數據均用SPSS 13.0軟件進行統計分析，數據以±s表示，多組間比較采用One-way ANOVA檢驗，兩組間比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、各組細胞增殖活性的檢測結果

HSF+空載體+H2O2組較HSF+空載體組細胞增殖活性明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.01）；HSF+β聯蛋白+H2O2組較HSF+空載體+H2O2組細胞增殖活性明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

二、各組細胞凋亡率檢測結果

HSF+空載體組細胞凋亡率是（3.407±0.217）%，HSF+空載體 +H2O2組細胞凋亡率是（24.555±1.793）%，HSF+β聯蛋白 +H2O2組細胞凋亡率是（15.360±0.755）%。HSF+空載體+H2O2組較HSF+空載體組細胞凋亡率明顯上升，差異有統計學意義（P＜0.01）。HSF+β聯蛋白+H2O2組較HSF+空載體+H2O2組細胞凋亡率明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖1。

三、各組HSF中Bcl-2、Bax的表達

HSF+空載體 +H2O2組較HSF+空載體組Bcl-2的表達水平明顯下調，而Bax水平明顯上升，差異有統計學意義（P＜0.01）。HSF+β聯蛋白+H2O2組較HSF+空載體+H2O2組Bcl-2的表達水平明顯上升，而Bax水平明顯下調，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

討 論

研究表明，氧化應激可以導致細胞增殖活性降低，引起細胞凋亡加速，導致細胞衰老。抑制氧化應激反應，可以提高細胞增殖活性，降低細胞凋亡，延緩細胞衰老［6-8］。在本實驗及我們既往的研究中發現，H2O2所致的人皮膚成纖維細胞衰老模型中，氧化應激水平（ROS活性）增高，衰老的人皮膚成纖維細胞增殖活性較正常人皮膚成纖維細胞增殖活性明顯降低，且細胞凋亡率較前明顯上調；轉染β聯蛋白后，氧化應激反應受到一定的抑制，ROS以及細胞凋亡率明顯下調，細胞增殖活性明顯提高，且延緩了細胞衰老表型［4-5］。

表1 各實驗組人皮膚成纖維細胞活性（±s）

表1 各實驗組人皮膚成纖維細胞活性（±s）

注：n=3，v=4。a：HSF+空載體+H2O2組與HSF+空載體組比較，P＜0.01；b：HSF+β 聯蛋白 +H2O2組與 HSF+空載體 +H2O2組比較，P＜0.01

組別 細胞活性（A值）HSF+空載體 0.792±0.012 HSF+空載體+H2O2 0.462±0.012a HSF+β聯蛋白+H2O2 0.521±0.015b

Bcl-2蛋白家族調控著內源性的線粒體凋亡通路，是抑制細胞凋亡的關鍵因子，參與細胞衰老［9］。Bcl-2基因的過表達有助于受損細胞的克隆修復，防止細胞程序性死亡，從而維持細胞永生化［10］。Bax是內在凋亡途徑中的一個關鍵的促凋亡分子，其插入到線粒體膜觸發釋放到細胞質中，從而導致細胞色素 C、caspase 活化和隨后的細胞凋亡［11］，Bax 蛋白的過度表達可加速細胞凋亡［12］。國外學者研究發現，β聯蛋白通過對Akt通路和Bcl-2家族成員的促凋亡蛋白Bax的影響，來調控神經細胞的凋亡［13］。另一學者通過對胸腺細胞中β聯蛋白和Bax的關系研究發現，β聯蛋白抗凋亡的部分原因是因為調控了 Bax 的表達［14］。Wang 等［15］研究發現，上調 β 聯蛋白可以靶向抑制Bax介導的線粒體膜的損傷，以及減輕生理應激所致的腎上皮細胞凋亡。我們的研究與國內外學者的研究較為一致，結果表明，在人皮膚細胞衰老模型中，抗凋亡基因Bcl-2的表達較對照組明顯下調，促凋亡基因Bax的活性較對照組明顯增強，可見氧化應激反應介導了細胞衰老和凋亡相關基因的表達。轉染β聯蛋白后，抗凋亡基因Bcl-2的表達明顯上調，促凋亡基因Bax的活性明顯被抑制，同時調控了衰老相關表型［5］。推測，β聯蛋白可能是通過上調凋亡基因Bcl-2的表達以及抑制促凋亡基因Bax的活性，來影響衰老的人皮膚成纖維細胞凋亡的。然而，β聯蛋白調控衰老的人皮膚成纖維細胞凋亡確切的細胞因子，可能的信號通路以及β聯蛋白調控人皮膚成纖維細胞凋亡與延緩人皮膚成纖維細胞衰老間的相互關系，尚待進一步研究。

圖1 HSF細胞凋亡散點圖。HSF+空載體+H2O2組與HSF+空載體組比較，差異有統計學意義，P＜0.01；HSF+β聯蛋白+H2O2組與HSF+空載體+H2O2組比較，P＜0.01

表2 HSF轉染前后Bcl-2、Bax mRNA和蛋白水平（±s）

表2 HSF轉染前后Bcl-2、Bax mRNA和蛋白水平（±s）

注：n=3，v=4。a：HSF+空載體+H2O2組與HSF+空載體組比較，P＜0.01；b：HSF+β聯蛋白+H2O2組與HSF+空載體+H2O2組比較，P＜0.01

組別 Bcl-2/GAPDH mRNA Bax/GAPDH mRNA Bcl-2/GAPDH蛋白 Bax/GAPDH蛋白HSF+空載體 0.507±0.013 0.303±0.005 0.514±0.021 0.320±0.013 HSF+空載體+H2O2 0.333±0.003a 0.451±0.002a 0.336±0.004a 0.460±0.008a HSF+β聯蛋白+H2O2 0.404±0.006b 0.339±0.012b 0.411±0.005b 0.346±0.013b

［1］Barker N.The canonical Wnt/beta-catenin signalling pathway［J］.MethodsMol Biol,2008,468（1）:5-15.

［2］Zhang W,Yan S,Liu M,et al.Beta-Catenin/TCF pathway plays a vital role in selenium induced-growth inhibition and apoptosis in esophageal squamous cell carcinoma （ESCC）cells［J］.Cancer Lett,2010,296（1）:113-122.

［3］Delmas V,Beermann F,Martinozzi S,et al.Beta-catenin induces immortalization of melanocytes by suppressing p16INK4a expression and cooperates with N-Ras in melanoma development［J］.Genes Dev,2007,21（22）:2923-2935.

［4］田黎明,謝紅付,李吉,等.氧化應激所致的人皮膚成纖維細胞衰老中β-連環蛋白的表達研究［J］.中華皮膚科雜志,2011,44（4）:259-262.

［5］田黎明,謝紅付,李吉,等.β聯蛋白對體外過氧化氫所致人皮膚成纖維細胞衰老表型的影響［J］.中華皮膚科雜志,2013,46（7）:484-488.

［6］Guo YL,Chakraborty S,Rajan SS,et al.Effects of oxidative stress on mouse embryonic stem cell proliferation,apoptosis,senescence,and self-renewal［J］.Stem Cells Dev,2010,19（9）:1321-1331.

［7］Watanabe K,Shibuya S,Koyama H,et al.Sod1 loss induces intrinsic superoxide accumulation leading to p53-mediated growth arrest and apoptosis［J］.Int J Mol Sci,2013,14（6）:10998-11010.

［8］Small DM,Bennett NC,Roy S,et al.Oxidative stress and cell senescence combine to cause maximal renal tubular epithelial cell dysfunction and loss in anin vitromodel of kidney disease［J］.Nephron Exp Nephrol,2013,122（3-4）:123-130.

［9］Schulman JJ,Wright FA,Kaufmann T,et al.The Bcl-2 family member Bok binds to the coupling domain of inositol 1,4,5-trisphosphate receptors and protects them from proteolytic cleavage［J］.J Biol Chem,2013,288（35）:25340-25349.

［10］Rahman F,Bhargava A,Tippu SR,et al.Analysis of the immunoexpression of Ki-67 and Bcl-2 in the pericoronal tissues of impacted teeth,dentigerous cysts and gingiva using software image analysis［J］.Dent Res J（Isfahan）,2013,10（1）:31-37.

［11］Kontos CK,Fendri A,Khabir A,et al.Quantitative expression analysis and prognostic significance of the BCL2-associated X gene in nasopharyngeal carcinoma:a retrospective cohort study［J］.BMC Cancer,2013,13:293.

［12］Sahu U,Sidhar H,Ghate PS,et al.A novel anticancer agent,8-methoxypyrimido［4′,5′:4,5］thieno（2,3-b）quinoline-4（3H）-one induces neuro 2a neuroblastoma celldeath through p53-Dependent, caspase-dependent and -Independent apoptotic pathways［J］.PLoS One,2013,8（6）:e66430.

［13］Chong ZZ,Maiese K.Targeting WNT,protein kinase B,and mitochondrial membrane integrity to foster cellular survivalin the nervous system［J］.Histol Histopathol,2004,19（2）:495-504.

［14］Liang H,Coles AH,Zhu Z,et al.Noncanonical Wnt signaling promotes apoptosis in thymocyte development［J］.J Exp Med,2007,204（13）:3077-3084.

［15］Wang Z,Havasi A,Gall JM,et al.Beta-catenin promotes survival of renal epithelial cells by inhibiting Bax ［J］.J Am Soc Nephrol,2009,20（9）:1919-1928.

“中國中藥杯”全國皮膚鏡攝影賽暨病例征集賽征稿通知

為了促進皮膚鏡在我國的應用，提高臨床診斷水平，促進中國皮膚科事業發展，中華醫學會皮膚性病學分會皮膚病數字化診斷亞學組與中國中藥有限公司共同舉辦以“鏡善鏡美”為主題的“中國中藥杯”全國皮膚鏡攝影賽暨病例征集賽。

一、征集內容：包含皮膚鏡照片（臨床皮膚病照片、皮膚鏡照片各一張）及配套病例。

二、作品要求：個人原創作品；內容圍繞皮膚科病例的主旨，主題明確，內容健康。

三、投稿郵箱和截止時間：投稿郵箱pifujing@163.com，截止時間：2015年6月30日。

四、獎品設置：一等獎：1名，便攜式皮膚鏡一臺（價值10 000元）；二等獎：2名，便攜式皮膚鏡一臺（價值6 500元）；三等獎3名，皮膚放大鏡一臺（價值2 500元）。所有參賽人員均可獲得紀念禮品，決賽于2015年7月中華醫學會第二十一次皮膚性病學術年會期間舉行，優秀作品可在年會展出。

詳細投稿須知及賽程安排可登陸中華醫學會皮膚性病學分會網站http://csd.cma.org.cn/查詢。

北京協和醫院皮膚科招收進修醫師通知

北京協和醫院皮膚科常年接受全國各省市三級以上醫院皮膚科醫師進修學習。條件如下：臨床進修醫師必須具備正規醫學院校本科及以上學歷（不包括續本），具備醫師資格證書和醫師執業證書以及從事3年以上臨床工作;每年招收兩期；報到時間為每年的3月和9月，進修期限為半年或一年。在北京協和醫院官網-醫學教育-進修國際合作頁面下載相關表格。郵寄紙質版進修申請表（加蓋醫院公章）至北京市東城區帥府園1號，北京協和醫院教育處，郵編100730，聯系電話010-69156878；信息表發送至電子郵箱xiehejinxiu@163.com。

Effects of β-catenin on the proliferative activity of and expressions of two apoptosis-related genes Bcl-2 and Bax by human skin fibroblasts induced by hydrogen peroxide

Tian Liming,Xie Hongfu,Li Ji,Yang Ting*,Peng Yuan,Hu Wei.*Affiliated Nanhua Hospital,University of South China,Hengyang 421002,Hunan,China

ObjectiveTo investigate the effect of highly expressed β-catenin on the proliferative activity of and expressions of two apoptosis-related genes Bcl-2 and Bax by human skin fibroblasts induced by hydrogen peroxide（H2O2）.MethodsNormal human skin fibroblasts （HSFs）from child foreskin were divided into three groups:empty vector group transfected with the empty vector pcDNA3.1,H2O2group transfected with the empty vector pcDNA3.1 followed by treatment with H2O2（150 μmol/L）for 2 hours,β-catenin group transfected with pcDNA3.1-β-catenin followed by treatment with H2O2（150 μmol/L）for 2 hours.Subsequently,methyl thiazolyl tetrazolium （MTT）assay was conducted to estimate proliferative activity of fibroblasts,flow cytometry to detect cell apoptosis,and reverse transcription （RT）-PCR and Western blot were performed to measure the mRNA and protein expressions of Bcl-2 and Bax respectively.The relative expression levels of genes were expressed as the ratios between the targets and GAPDH.ResultsSignificant differences were found between the empty vector group,H2O2group and β-catenin group in cellular proliferative activity（expressed as absorbance value at 570 nm:0.792±0.012 vs.0.462±0.012 vs.0.521±0.015,P＜0.01）and apoptosis rate（3.407%±0.217%vs.24.555% ±1.793%vs.15.360%±0.755%,P＜0.01）.Both mRNA and protein expression levels of Bcl-2 were significantly lower in the H2O2group（0.333±0.003 and 0.336±0.004 respectively）than in the empty vector group（0.507±0.013 and 0.514±0.021,respectively,bothP＜ 0.01）and β-catenin group（0.404±0.006 and 0.411±0.005,respectively,bothP＜0.01）.Increased expression levels of Bax mRNA and protein were observed in the H2O2group compared with the empty vector group and β-catenin group（mRNA:0.451±0.002 vs.0.303±0.005 and 0.339±0.012,protein:0.460±0.008 vs.0.320±0.013 and 0.346±0.013,allP ＜ 0.01）.ConclusionHigh expression of β-catenin can raise proliferative activity of aging HSFs.

Fibroblasts;Cell aging;β-catenin;Apoptosis;Genes,Bcl-2;Genes,Bax

Tian Liming，Email：jolly521@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.02.013

國家自然科學基金青年科學基金（81101212）；湖南省自然科學衡陽聯合基金（10JJ9018）；湖北省自然科學基金（2012FFC083）；中國皮膚科醫師協會-寶潔基金（2010CDA-P&G04）；中國皮膚科醫師協會-復旦張江光動力基金（2012CDA-FDZJ01）；武漢市衛生局科學基金（WX12B20）；南華大學附屬南華醫院院內科研課題（10nyz01）

421002湖南衡陽，南華大學附屬南華醫院［田黎明（現在華中科技大學附屬武漢市第一醫院皮膚科，430022武漢）、楊婷、胡威］；中南大學湘雅醫院皮膚科（謝紅付、李吉）；湖北中醫藥大學基礎醫學院（彭圓）

田黎明，Email：jolly521@126.com

2014-06-05）

（本文編輯：吳曉初）