重組人色素上皮衍生因子對(duì)HaCaT細(xì)胞體外增殖和白細(xì)胞介素6、8及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

李小瓊 魏志平 劉彥群

·研究報(bào)道·

重組人色素上皮衍生因子對(duì)HaCaT細(xì)胞體外增殖和白細(xì)胞介素6、8及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

李小瓊 魏志平 劉彥群

目的 探討重組人色素上皮衍生因子（rhPEDF）對(duì)HaCaT細(xì)胞體外增殖和白細(xì)胞介素6（IL-6）、IL-8及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)的影響。方法 HaCaT細(xì)胞分4組進(jìn)行不同處理，分別為100 μg/L rhPEDF組、50 μg/L rhPEDF組、25 μg/L rhPEDF組及對(duì)照組（只加RPMI 1640培養(yǎng)液）。采用CCK8法檢測(cè)不同濃度rhPEDF作用于HaCaT細(xì)胞24、48、72 h后對(duì)細(xì)胞體外增殖的影響。RT-PCR和Western印跡法檢測(cè)rhPEDF對(duì)HaCaT細(xì)胞IL-6、IL-8、VEGF mRNA及其蛋白表達(dá)的影響。統(tǒng)計(jì)分析方法采用兩因素方差分析、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)以及Pearson相關(guān)分析。結(jié)果 25、50、100 μg/L的rhPEDF作用24、48、72 h后對(duì)HaCaT細(xì)胞體外增殖均有不同程度的抑制作用。隨時(shí)間延長(zhǎng)和rhPEDF濃度的增加，rhPEDF對(duì)HaCaT細(xì)胞體外增殖的抑制作用均逐漸增強(qiáng)（F=1115、329.9，均P＜0.001）。與對(duì)照組相比，不同濃度（100、50、25 μg/L）rhPEDF作用于HaCaT細(xì)胞48 h后，VEGF、IL-6、IL-8 mRNA及蛋白的表達(dá)均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨rhPEDF濃度的增加，各濃度rhPEDF組VEGF mRNA、IL-6和IL-8蛋白表達(dá)均出現(xiàn)下調(diào)，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；100 μg/L rhPEDF組的IL-6、IL-8 mRNA表達(dá)明顯低于25 μg/L rhPEDF組（P＜0.05）；100 μg/L rhPEDF組 VEGF蛋白表達(dá)分別低于 50、25 μg/L rhPEDF組（P＜0.05），而 50與25 μg/L rhPEDF組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 rhPEDF可抑制HaCaT細(xì)胞體外增殖，并可在mRNA及蛋白水平下調(diào)IL-6、IL-8、VEGF的表達(dá)。

角蛋白細(xì)胞；白細(xì)胞介素8；白細(xì)胞介素6；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子類(lèi)；銀屑病；色素上皮衍生因子；HaCaT細(xì)胞

色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor，PEDF）是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的一員，具有神經(jīng)保護(hù)作用，能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，抑制血管新生［1］。在膀胱癌及前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，PEDF與白細(xì)胞介素 8（IL-8）的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表現(xiàn)出抗炎作用［2-3］。Nakamura等［4］在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者血清中PEDF與IL-6呈負(fù)相關(guān)。Abe等［5］首次報(bào)告，PEDF源性肽能減輕銀屑病小鼠模型的棘層增厚和血管新生。本實(shí)驗(yàn)研究了重組人色素上皮衍生因子（rhPEDF）對(duì)HaCaT細(xì)胞體外增殖和 IL-6、IL-8、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)的影響，探討PEDF在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的作用。

一、材料與方法

1.細(xì)胞與試劑：人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞（上海復(fù)祥生物科技有限公司），rhPEDF（美國(guó)Peprotech公司），RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），兔抗人IL-6、IL-8單克隆抗體（美國(guó)bioworld公司），兔抗人VEGF單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），鼠抗人β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司），堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，馬抗小鼠IgG抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），BCA試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），RT-PCR引物設(shè)計(jì)［生工生物工程（上海）股份有限公司］，逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］。

2.細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組：HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素、鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后，用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h貼壁后，更換無(wú)血清、無(wú)雙抗RPMI 1640培養(yǎng)液，并加入不同濃度rhPEDF。HaCaT細(xì)胞分為4 組，分別為 100 μg/L rhPEDF 組、50 μg/L rhPEDF 組、25 μg/L rhPEDF組及只加RPMI 1640培養(yǎng)液的對(duì)照組。

3.CCK8法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞體外增殖：取HaCaT細(xì)胞6×103個(gè)/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，培養(yǎng)24h，細(xì)胞貼壁后，按上述實(shí)驗(yàn)分組分別加入不同濃度rhPEDF。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h后終止培養(yǎng)，棄去原培養(yǎng)基，將無(wú)血清、無(wú)雙抗RPMI 1640培養(yǎng)液與CCK8試劑按10∶1比例混勻，每孔加入100 μl，于培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處每孔的吸光度（A值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖抑制率=（1－給藥組A值/對(duì)照組A值）×100%。

4.RT-PCR法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞IL-6、IL-8、VEGF mRNA表達(dá)：實(shí)驗(yàn)分組同上，培養(yǎng)24 h后提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。目的基因IL-6上游引物：5′-ATTCCTTCTTCTGG TCAGAAACC-3′，下游引物：3′-ACAAAGGATATTCAAACTG CATAGC-5′，擴(kuò)增片段為 205 bp；IL-8 上游引物：5′-TCTTGG CAGCCTTCCTGATTT-3′，下游引物：5′-CTGGCATCTTCACTG ATTCTTGG-3′，擴(kuò)增片段為 320 bp；VEGF 上游引物：5′-CATGAACTTTCTGCTGTCTTGG-3′，下游引物：5′-GGTCTGC ATTCACATTTGTTGT-3′，擴(kuò)增片段為396 bp；內(nèi)參β肌動(dòng)蛋白上游引物：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，下游引物：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′，擴(kuò)增片段為241 bp。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。PCR反應(yīng)體系為25 μl，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后 72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照，檢測(cè)各電泳條帶的灰度值，計(jì)算與β肌動(dòng)蛋白比值，得到目的產(chǎn)物的相對(duì)含量。

5.Western印跡法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞IL-6、IL-8及VEGF的表達(dá)：實(shí)驗(yàn)分組同上，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，提取總蛋白，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，上樣80 μg進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉，一抗孵育（兔抗人IL-6、IL-8單克隆抗體滴度為1∶1 000；兔抗人VEGF單克隆抗體為1∶200，鼠抗人β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體為1∶500），4℃過(guò)夜，二抗孵育（山羊抗兔IgG抗體的工作滴度為 1∶500；馬抗小鼠 IgG 抗體為 1∶500）2 h，BCIP/NBT顯色液顯色，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，目的蛋白條帶IL-6、IL-8、VEGF與相應(yīng)內(nèi)參β肌動(dòng)蛋白條帶的灰度值比值作為其蛋白表達(dá)的半定量指標(biāo)。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用±s表示。分析rhPEDF對(duì)HaCaT細(xì)胞體外增殖的影響隨時(shí)間和濃度變化的趨勢(shì)采用兩因素方差分析；多個(gè)均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；相關(guān)分析用Pearson相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

1.rhPEDF 對(duì) HaCaT 細(xì)胞增殖的影響：25、50、100 μg/L的rhPEDF作用24、48、72 h后對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖均有不同程度的抑制。隨時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用逐漸增強(qiáng)（F=1 115.000，P<0.001）；隨rhPEDF濃度增加，抑制作用也逐漸增強(qiáng)（F=329.900，P<0.001）；時(shí)間和濃度之間存在交互作用（F=72.148，P<0.001），說(shuō)明時(shí)間因素的變化趨勢(shì)隨rhPEDF濃度不同而不同。見(jiàn)表1。

2.rhPEDF對(duì) HaCaT細(xì)胞 IL-6、IL-8、VEGF mRNA 及其蛋白表達(dá)的影響：與對(duì)照組相比，不同濃度rhPEDF作用于HaCaT細(xì)胞48 h后，VEGF、IL-6、IL-8 mRNA 及蛋白的表達(dá)均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨rhPEDF濃度的增加，VEGF mRNA、IL-6和IL-8蛋白均出現(xiàn)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）；100 μg/L rhPEDF 組的 IL-6、IL-8mRNA 表達(dá)明顯低于 25 μg/L rhPEDF 組（P ＜ 0.05）；100 μg/L rhPEDF組VEGF蛋白表達(dá)分別低于50、25 μg/L rhPEDF組（P＜0.05），而在50和25 μg/L rhPEDF組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表1 重組人色素上皮衍生因子（rhPEDF）作用于HaCaT細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)增殖抑制率的影響（%± s，n=3）

表1 重組人色素上皮衍生因子（rhPEDF）作用于HaCaT細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)增殖抑制率的影響（%± s，n=3）

組別 24 h 48 h 72 h 100 μg/L rhPEDF 26.33±2.11 37.65±2.36 50.19±1.09 50 μg/L rhPEDF 19.32±2.46 27.82±0.87 41.92±3.01 25 μg/L rhPEDF 13.96±1.49 19.37±2.50 35.62±1.90

表2 重組人色素上皮衍生因子（rhPEDF）對(duì)HaCaT細(xì)胞白細(xì)胞介素6和8、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及其mRNA表達(dá)的影響（± s，n=3）

表2 重組人色素上皮衍生因子（rhPEDF）對(duì)HaCaT細(xì)胞白細(xì)胞介素6和8、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及其mRNA表達(dá)的影響（± s，n=3）

注：不同濃度rhPEDF組白細(xì)胞介素6和8、VEGF及其mRNA相對(duì)表達(dá)量分別與對(duì)照組相比，均P＜0.05

組別 白細(xì)胞介素6 白細(xì)胞介素8 VEGF mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白100 μg/L rhPEDF 0.411±0.098 0.637±0.022 0.551±0.049 0.411±0.015 0.507±0.109 0.428±0.082 50 μg/L rhPEDF 0.567±0.066 0.761±0.038 0.700±0.073 0.501±0.015 0.695±0.027 0.700±0.091 25 μg/L rhPEDF 0.755±0.048 0.939±0.049 0.763±0.071 0.695±0.039 0.874±0.063 0.838±0.093對(duì)照組 1.031±0.197 1.153±0.007 0.974±0.129 0.848±0.021 1.035±0.059 1.106±0.071 F值 15.436 165.000 12.441 169.834 30.300 36.627 P值 0.001 ＜0.001 0.002 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

三、討論

PEDF在人體中分布廣泛，具有抗增殖、抗血管新生、抗炎等作用，現(xiàn)已成為腫瘤及血管新生、炎癥性相關(guān)疾病治療的新靶點(diǎn)［1］。銀屑病是慢性炎癥性皮膚病，其組織病理學(xué)特征包括角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖，角化不全，表皮內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，真皮乳頭血管增生、迂曲等［6］。Li等［7］的研究表明，rhPEDF對(duì)HaCaT細(xì)胞體外增殖具有抑制作用，并發(fā)現(xiàn)VEGF165能夠促進(jìn)HaCaT細(xì)胞PEDF的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明，rhPEDF對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用。

PEDF不僅能夠抑制多種細(xì)胞增殖，還是重要的血管生長(zhǎng)抑制因子［1］。微血管生成異常與銀屑病的發(fā)生發(fā)展、持續(xù)存在及復(fù)發(fā)有密切關(guān)系，VEGF是新血管生成不可缺少的誘導(dǎo)因子［8］。銀屑病皮損中大量增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞分泌VEGF，并能促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌較多的促炎因子如IL-6和IL-8［9］。研究發(fā)現(xiàn)，PEDF能抑制腫瘤細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的表達(dá)［1］，而PEDF源性肽能抑制銀屑病小鼠模型的血管新生［5］，推測(cè)PEDF通過(guò)抑制角質(zhì)形成細(xì)胞VEGF表達(dá)，進(jìn)而抑制銀屑病的血管新生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，隨著rhPEDF濃度增高，HaCaT細(xì)胞中VEGF mRNA和蛋白表達(dá)逐漸下調(diào)。

在糖尿病視網(wǎng)膜疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，PEDF不僅抑制VEGF的表達(dá)，而且抑制TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達(dá)，表現(xiàn)出抗炎作用［10］。Hirsch 等［3］的研究表明，PEDF 能夠通過(guò)抑制前列腺癌細(xì)胞中IL-8的表達(dá)，達(dá)到抗炎及抗增殖作用。Nakamura等［4］認(rèn)為，PEDF可能在銀屑病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮抗炎作用。銀屑病皮損角質(zhì)形成細(xì)胞通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子參與局部免疫反應(yīng)，如IL-8參與中性粒細(xì)胞聚集及膿腫的形成，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［11］。研究表明，銀屑病皮損局部及外周血中IL-6、IL-8表達(dá)均增高，高表達(dá)的IL-6、IL-8又能促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增生［11-12］。因此，抑制銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，對(duì)抑制炎癥反應(yīng)有重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rhPEDF能夠抑制HaCaT細(xì)胞IL-6、IL-8 mRNA和蛋白的表達(dá)。

［1］Liu JT,Chen YL,Chen WC,et al.Role of pigment epitheliumderived factor in stem/progenitor cell-associated neovascularization［J］.J Biomed Biotechnol,2012,2012:871272.

［2］Feng C,Guan M,Ding Q,et al.Expression of pigment epitheliumderived factor in bladder tumour is correlated with interleukin-8 yet not with interleukin-1α ［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2011,31（1）:21-25.

［3］Hirsch J,Johnson CL,Nelius T,et al.PEDF inhibits IL8 production in prostate cancer cells through PEDF receptor/phospholipase A2 and regulation of NFκB and PPARγ ［J］.Cytokine,2011,55（2）:202-210.

［4］Nakamura K,Yamagishi S,Adachi H,et al.Serum levels of pigmentepithelium-derived factor （PEDF） are positively associated with visceral adiposity in Japanese patients with type 2 diabetes［J］.Diabetes Metab Res Rev,2009,25（1）:52-56.

［5］Abe R,Yamagishi S,Fujita Y,et al.Topical application of antiangiogenic peptides based on pigment epithelium-derived factor can improve psoriasis［J］.J Dermatol Sci,2010,57（3）:183-191.

［6］Lowes MA,Bowcock AM,Krueger JG.Pathogenesis and therapy of psoriasis［J］.Nature,2007,445（7130）:866-873.

［7］Li CM,Li W,Man XY,et al.Pigment epithelium-derived factor plays an inhibitory role in proliferation and migration of HaCaT cells［J］.Mol Biol Rep,2011,38（3）:2099-2105.

［8］Wary KK,Thakker GD,Humtsoe JO,et al.Analysis of VEGF-responsive genes involved in the activation of endothelial cells［J］.Mol Cancer,2003,2:25.

［9］Kakurai M,Demitsu T,Umemoto N,et al.Vasoactive intestinal peptide and inflammatory cytokines enhance vascular endothelial growth factor production from epidermal keratinocytes ［J］.Br J Dermatol,2009,161（6）:1232-1238.

［10］Liu Y,Leo LF,McGregor C,et al.Pigment epithelium-derived factor（PEDF）peptide eye drops reduce inflammation,cell death and vascular leakage in diabetic retinopathy in Ins2 （Akita）mice［J］.Mol Med,2012,18:1387-1401.

［11］Szepietowski J,Walker C,Hunter JA,et al.Elevated leukaemia inhibitory factor （LIF） expression in lesional psoriatic skin:correlation with interleukin （IL）-8 expression ［J］.J Dermatol,2001,28（3）:115-122.

［12］H?nel KH,Cornelissen C,Lüscher B,et al.Cytokines and the skin barrier［J］.Int J Mol Sci,2013,14（4）:6720-6745.

Effects of recombinant human pigment epithelium derived factor onin vitroproliferation of and expressions of interleukin-6,-8 and vascular endothelial growth factor in cultured human HaCaT keratinocytes

Li Xiaoqiong,Wei Zhiping,Liu Yanqun.Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College,Xuzhou 221002,Jiangsu,China

ObjectiveTo investigate the effects of recombinant human pigment epithelium derived factor（rhPEDF）onin vitroproliferation of and expressions of interleukin 6（IL-6）,IL-8 and vascular endothelial growth factor（VEGF）in cultured human HaCaT keratinocytes.MethodsSome cultured HaCaT cells were treated with rhPEDF at various concentrations（25,50,100 μg/L）for different durations,and some treated with RPMI 1640 medium only served as the control group.Cell counting kit-8（CCK8）assay was performed to evaluate cell proliferation after 24-,48-and 72-hour treatment,reverse transcription （RT）-PCR to measure the mRNA expressions of IL-6,IL-8 and VEGF in HaCaT cells after 24-hour treatment,and Western blot to detect the protein expressions of IL-6,IL-8 and VEGF in HaCaT cells after 48-hour treatment.Statistical analysis was carried out by two-and one-way analysis of variance,Student-Newman-Keuls（SNK）-qtest and Pearson correlation analysis.ResultsAfter treatment with rhPEDF of 25－100 μg/L for 24 － 72 hours,the proliferation of HaCaT cells was significantly inhibited to different extents compared with the control group（all P ＜ 0.05）,and the inhibition rate significantly increased with the increase in treatment duration and concentrations of rhPEDF（F=1115,329.9,respectively,bothP ＜ 0.001）.Moreover,there was a significant decrease in the expressions of IL-6,IL-8 and VEGF mRNAs（at 24 hours）and proteins（at 48 hours）in HaCaT cells after treatment with rhPEDF of 25 － 100 μg/L compared with the control group（allP ＜ 0.05）.The expression levels of VEGF mRNA as well as IL-6 and IL-8 proteins all significantly decreased with the increase of rhPEDF concentrations （allP ＜ 0.05）.The mRNA expressions of IL-6 and IL-8 were significantly lower in the 100-μg/L rhPEDF group than in the 25-μg/L rhPEDF group（bothP ＜ 0.05）,and the protein expression of VEGF was significantly weaker in the 100-μg/L rhPEDF group than in 25-and 50-μg/L rhPEDF groups （bothP ＜ 0.05）,but similar between the 25-and 50-μg/L rhPEDF groups （P ＞ 0.05）.ConclusionsrhPEDF can inhibit the proliferation of HaCaT cells,and down-regulate the mRNA and protein expressions of IL-6,IL-8 and VEGF.

Keratinocytes;Interleukin-8;Interleukin-6;Vascular endothelial growth factors;Psoriasis;Pigment epithelium derived factor;HaCaT cells

Wei Zhiping,Email:xzwzp1961@aliyun.com

作者單位：221002江蘇，徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.08.015

魏志平，Email：xzwzp1961@aliyun.com

2014-10-24）

（本文編輯：周良佳 顏艷）