紋黨多糖對四氧嘧啶誘導糖尿病大鼠血糖血脂的影響

葉文斌，樊　亮（隴南師范高等專科學校農(nóng)林技術(shù)學院，甘肅隴南742500）

紋黨多糖對四氧嘧啶誘導糖尿病大鼠血糖血脂的影響

葉文斌，樊亮
（隴南師范高等專科學校農(nóng)林技術(shù)學院，甘肅隴南742500）

研究紋黨多糖（Codonopisis pilosula polysaccharide，CPP）對四氧嘧啶誘導糖尿病大鼠血糖和血脂的影響。以腹腔注射四氧嘧啶（ALX）構(gòu)建大鼠糖尿病模型，將建模成功的大鼠隨機分為糖尿病模型組、CPP高、中、低劑量處理組、陽性對照組（二甲雙胍處理組、格列苯脲處理組和腎上腺素處理組），以生理鹽水為空白對照組。連續(xù)灌胃給藥28 d，研究CPP對糖尿病大鼠空腹血糖（FBG）、糖化血紅蛋白（HbAlc）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）等指標的影響。結(jié)果顯示，CPP能明顯降低正常大鼠血糖，能極顯著（p＜0.01）降低腎上腺素引起的高血糖，能夠有效降低糖尿病大鼠的FBG、HbAlc、TC、TG，升高HDL含量。紋黨多糖能夠顯著降低糖尿病大鼠血糖并顯著改善糖尿病大鼠血脂代謝紊亂。

紋黨，多糖，糖尿病大鼠，降血糖，降血脂

近年來，糖尿病（Diabetes mellitus，DM）及其并發(fā)癥的發(fā)生率越來越高，已成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后嚴重危害人類健康的常見病和多發(fā)病。世界衛(wèi)生組織（WHO）估計全世界DM患者2025年將達到3億［1］。有研究報道糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展與患者的血糖波動有密切關(guān)系［2］。高糖環(huán)境會引起糖脂代謝的紊亂，造成體內(nèi)臟器抗氧化酶表達和活性的降低及脂質(zhì)過氧化水平的升高，導致并發(fā)癥的發(fā)生［3］。人體血液中糖化血紅蛋白（HbAlc）與血糖濃度成正比，所以HbAlc水平能更好地反映機體糖代謝的情況［4］。Khan等［5］研究證實HbAlc與空腹血糖（FBG）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）呈正相關(guān)。因此，有效調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂對治療糖尿病及其并發(fā)癥有重要意義。黨參是桔梗科植物黨參［Codonopisis pilosula（Franch.）Nannf.］的根，主產(chǎn)于甘肅、山西、陜西、四川等省，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有補中益氣，健脾益肺之功效，主治脾肺虛弱，氣短心悸、內(nèi)熱消渴等癥［6］。隴南市文縣出產(chǎn)的紋黨質(zhì)量最好［7］，是中國國家地理標志產(chǎn)品。紋黨多糖（Codonopisis pilosula polysaccharide，CPP）系其主要有效成分，具有廣泛的藥理作用［1］。有研究報道黨參多糖對小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能有激活作用［8］，還對正常脾淋巴細胞增殖、抗體生成均有促進作用［9-11］，能顯著提高免疫受抑小鼠免疫水平［12］，有清除自由基的作用，還可以增加SOD活性，減少MDA的生成［13-14］；對小鼠神經(jīng)干細胞損傷有明顯保護作用［15］，對小鼠延緩衰老、提高小鼠記憶力都有明顯的效果［16-20］，對氫化可的松琥珀酸鈉誘導的小鼠胰島素抵抗有顯著的改善作用［21］。

為此，本文采用四氧嘧啶（ALX）誘導糖尿病大鼠模型研究紋黨多糖作用對糖尿病大鼠的降血糖作用效果，以期為開發(fā)無毒無副作用的降糖替代藥物等紋黨多糖綜合開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

紋黨由甘肅省隴南市文縣中寨種植基地提供；SD大鼠雄性，合格證號SCXK（甘）2009-0004，體重185～220 g，購自蘭州大學醫(yī)學院；飼料購自蘭州大學醫(yī)學院；四氧嘧啶Sigma公司；鹽酸二甲雙胍片上海醫(yī)藥（集團）有限公司信誼制藥總廠生產(chǎn)；格列苯脲片上海信誼藥廠有限公司生產(chǎn)；血糖試紙愛奧樂醫(yī)療器械（深圳）有限公司；普魯卡因腎上腺素注射液遠大醫(yī)藥（中國）有限公司生產(chǎn)；復合酶（β-葡聚糖酶≥300萬U/mL，纖維素酶≥40萬U/mL，木聚糖酶≥260萬U/mL，果膠酶≥2萬U/mL） 和氏璧生物科技有限公司。

電子天平上海奧豪斯儀器有限公司；SK5200H超聲波清洗儀上海科導超聲儀器有限公司；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋上海千載科技有限公司；TGL-16G高速臺式離心機、TDL-5000B型低速冷凍大容量離心機上海安亭科學儀器廠；UV759紫外-可見分光光度計上海精密科學儀器有限公司；LGJ-18型冷凍干燥機北京四環(huán)科學儀器廠；AU5800全自動生化分析儀貝克曼庫爾特有限公司；全自動血糖檢測儀愛奧樂醫(yī)療器械（深圳）有限公司等。

1.2實驗方法

1.2.1紋黨多糖的提取流程將紋黨塊莖在50℃烘干后粉碎，過40目篩，用無水乙醇回流脫脂，50℃烘干，取50 g后加入500 mL水，在48℃溫度下添加0.50 g的復合酶進行酶解提取12 h，提取液經(jīng)過減壓濃縮得濃縮液，取上清液與Sevag試劑（氯仿∶正丁醇體積比4∶1）按體積比5∶1混合，振蕩，5000 r/min離心棄去上層變性蛋白，重復4次。合并水層，用95%的乙醇沉淀（體積比3∶1），5000 r/min離心10 min，沉淀物溶于48℃熱水中，攪拌狀態(tài)下慢慢加入斐林試劑，析出銅絡(luò)合物，靜置1 h，傾出上清液，用水洗滌3次，5000 r/min離心分離得絡(luò)合物，向絡(luò)合物中加4℃蒸餾水，再滴加0.5 mol/L HCl使之全部溶解，用95%的乙醇沉淀（體積比3∶1），5000 r/min離心，所得絮狀物分別用乙醇、丙酮、乙醚洗滌，冷凍干燥得紋黨多糖粉末，后經(jīng)過DEAE-纖維素柱層析，再過Sephadex G柱純化后真空冷凍干燥得到純化的紋黨多糖［22］。

紋黨多糖含量的測定：采用苯酚-硫酸法測定總的紋黨多糖含量。HPLC-GPC色譜檢測多糖純度，用面積歸一化法進行計算。液相色譜條件：色譜柱：Shodex SUGAR SP-G 0810糖分析柱；流動相：純H2O；流速：1.0 mL/min；檢測器：Shodex RI-10A示差折光檢測器；柱溫：80℃；進樣量：20μL。

1.2.2紋黨多糖對正常大鼠血糖水平的影響取SD大鼠50只，隨機分為5組。設(shè)格列本脲為藥物對照組，按25 mg/kg bw劑量每天灌胃一次；建立紋黨多糖低、中、高劑量組，按照100、250、500 mg/kg bw標準每天灌胃一次紋黨多糖；連續(xù)灌胃7 d。大鼠自由飲食和飲水，以喂食相同體積的生理鹽水為空白組，末次給藥后1 h眼眶靜脈叢采血，用血糖儀測定FBG。

1.2.3紋黨多糖對正常大鼠糖耐量的影響取SD大鼠60只，隨機分為6組，設(shè)二甲雙胍對照組，紋黨多糖低、中、高劑量組，以喂食相同體積的生理鹽水為空白組，各組灌胃給藥方法依照1.2.2，連續(xù)灌胃7 d，末次給藥前禁食12 h，給藥后30 min除空白對照外其他各組灌胃10%葡萄糖20 mL/10kg bw一次，同時設(shè)葡萄糖處理組（正常小鼠灌胃相同劑量的葡萄糖一次），灌胃葡萄糖后0、0.5、1、2 h眼眶靜脈叢采血，用血糖儀測定各組大鼠的FBG。

1.2.4紋黨多糖對腎上腺素引起高血糖大鼠血糖水平的影響取60只SD大鼠，隨機分成6組，分組及給藥方法同1.2.2，設(shè)二甲雙胍對照組，除空白對照外其他各組每天按0.2 mg/kg bw的標準腹腔注射一次腎上腺素，連續(xù)注射7 d，同時設(shè)腎上腺素處理組。末次給藥前禁食12 h，給藥30 min后眼眶采血，用血糖儀測定FBG。

1.2.5糖尿病動物模型建立將正常SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，在禁食不禁水12 h后，稱重后，測量FBG。隨機取10只大鼠作為正常對照組，將其余60只大鼠腹腔一次性注射240 mg/kg bw新鮮配制的3%ALX溶液，72 h后眼眶靜脈叢采血，用血糖儀測定FBG，將FBG≥11.5 mmol/L者視為糖尿病大鼠造模成功，造模成功后50只的糖尿病模型大鼠，隨機分為5組，每組10只，分別設(shè)置ALX模型組、二甲雙胍藥物對照組、紋黨多糖低、中、高劑量組。紋黨多糖低、中、高劑量組每天灌胃一次紋黨多糖，灌胃劑量依次為100、250和500 mg/kg bw；二甲雙胍藥物對照組每天灌胃一次250 mg/kg bw劑量的二甲雙胍。在實驗期間，各組大鼠自由飲食和飲水，連續(xù)灌胃28 d，每隔7 d稱量體重、眼眶靜脈叢取血，用血糖儀測各組大鼠FBG。末次給藥后，各組大鼠禁食不禁水12 h，剪尾采血，4000 r/min離心收集血清，采用全自動生化分析儀測TC、TG、HDL、LDL水平，并測定糖化血紅蛋白。

糖化血紅蛋白測定：各處理組剪尾采血樣品，收集于試管后，加入EDTA抗凝，分別取400 μL加入試劑盒混合均勻，放置10 min制成糖化血紅蛋白。再分別吸取3 mL陽離子樹脂加入到試管中，再加入已制好的糖化血紅蛋白，將層析柱插入試管中，充分搖蕩試管混合10 min，取上清液在415 nm處測定吸光值，以蒸餾水調(diào)零。糖化血紅蛋白計算公式如下。

糖化血紅蛋白（%）=糖化血紅蛋白吸光度×100 1.2.6大鼠口服（灌胃）急性毒性實驗［23］選取50只SD大鼠，隨機分成5組，一組大鼠為空白對照組。實驗組大鼠進行紋黨多糖灌服，灌服劑量分別為10000、20000、40000和60000 mg/kg bw，給藥后籠邊觀察。給藥后先觀察30 min，給藥后4 h再觀察1次，以后每天早晚各觀察1次，連續(xù)觀察7 d。觀察的主要內(nèi)容有皮毛組織光滑度、眼角膜是否有血絲、紅腫現(xiàn)象、大鼠活動是否有異常行為，以及對大鼠進行剖檢，觀察大鼠各組織器官的變化。

1.3統(tǒng)計分析

2　結(jié)果與分析

2.1紋黨多糖表征

紋黨經(jīng)過復合酶酶解后進行分離提取、脫色和真空冷凍干燥后得到潔白的紋黨多糖粉，經(jīng)過測定多糖得率為28.83%，將所得紋黨多糖配成0.01%的多糖溶液紫外光譜在260 nm和280 nm波長處未見蛋白質(zhì)和核酸的特征吸收，在HPLC-GPC色譜檢測中只出現(xiàn)一個峰且沒有裂峰的出現(xiàn)，表明得到的紋黨多糖是由一種多糖組成的，面積歸一化計算純度為99.95%。

2.2紋黨多糖對正常大鼠血糖水平的影響

格列本脲能刺激胰腺胰島B細胞分泌胰島素，還通過增加門靜脈胰島素水平或?qū)Ω闻K直接作用，抑制肝糖原分解和糖原異生作用，也可能增加胰外組織對胰島素的敏感性和糖的利用。如表1所示，紋黨多糖低、中、高劑量組均能降低正常大鼠血糖，與空白組比較均有極顯著性（p＜0.01）降血糖作用，而紋黨多糖低、中、高劑量組降血糖作用明顯低于格列苯脲組（p＜0.01），降糖效果顯得較為溫和。

表1　紋黨多糖對正常大鼠血糖水平的影響Table 1　Effect of CPP on blood glucose in Sprague-Dawley rats

2.3紋黨多糖對正常大鼠葡萄糖耐量的影響

對各組大鼠灌胃葡萄糖后血糖都開始升高，結(jié)果見表2。黨參多糖高劑量組與葡萄糖組相比，在0.5～2 h時FBG均極顯著降低（p＜0.01），而與二甲雙胍組無顯著差異（p＞0.05）。低、中劑量組在0.5～2 h內(nèi)FBG極顯著（p＜0.01）低于葡萄糖組，且極顯著（p＜0.01）高于二甲雙胍組。所以，紋黨多糖低、中、高劑量對正常小鼠口服葡萄糖耐量都有明顯的改善作用，且高劑量組與二甲雙胍組效果相當，但紋黨多糖低、中劑量組不及二甲雙胍組。

表2　紋黨多糖對正常大鼠FBG的影響（mmol/L）Table 2　Effect of CPP on glucose tolerance in Sprague-Dawley rats（mmol/L）

2.4紋黨多糖對腎上腺素引起高血糖大鼠血糖的影響

由表3可知，二甲雙胍和紋黨中、高劑量組大鼠血糖水平與腎上腺素處理組血糖水平均存在極顯著差異（p＜0.01），低劑量組與腎上腺素引起大鼠血糖水平有顯著差異（p＜0.05）。紋黨多糖對腎上腺素引起的大鼠血糖升高具有明顯的抑制作用。與二甲雙胍處理組相比，低劑量組的血糖水平極顯著（p＜0.01）高于二甲雙胍處理組，而紋黨多糖中、高劑量顯著（p＜0.05）高于二甲雙胍組。所以，紋黨多糖中、高劑量對腎上腺素致高血糖大鼠血糖水平都有明顯的改善作用，但均不及二甲雙胍組，效果較為緩和。

表3　紋黨多糖對腎上腺素致高血糖大鼠血糖水平的影響Table 3　Effect of CPP on blood glucose in adrenaline-induced diabetic rats

表4　紋黨多糖對糖尿病大鼠空腹血糖的影響（mmol/L）Table 4　Effect of CPP on blood glucose in alloxan-induced diabetic rats（mmol/L）

2.5紋黨多糖對糖尿病大鼠血糖的影響

紋黨多糖對造模成功后糖尿病大鼠血糖的作用見表4。各組大鼠血糖均明顯升高且與空白組大鼠之間存在極顯著差異（p＜0.01）。連續(xù)灌胃給藥28 d后，二甲雙胍組和紋黨多糖高、中、低劑量組大鼠血糖明顯降低，與ALX模型組均存在極顯著差異（p＜0.01）；而在連續(xù)灌胃給藥28 d后，紋黨多糖低、中劑量處理組大鼠的血糖值極顯著（p＜0.01）高于二甲雙胍組，降糖效果比二甲雙胍差，而高劑量組與二甲雙胍組比較血糖無顯著差異。綜上，紋黨多糖對糖尿病模型大鼠具有明顯的降血糖作用，且高劑量組降血糖效果最好，與二甲雙胍組無顯著差異（p＞0.05）。

2.6紋黨多糖對糖尿病大鼠糖化血紅蛋白的影響

如表5所示，連續(xù)灌胃給藥28d后紋黨多糖高劑量組大鼠糖化血紅蛋白含量與模型組比較極顯著下降（p＜0.01），中劑量組與模型組比較顯著下降（p＜0.05），低劑量組大鼠糖化血紅蛋白含量與模型組比較無顯著性差異（p＞0.05）；而模型組、二甲雙胍組和紋黨多糖高、中、低劑量組與空白對照相比均極顯著（p＜0.01）升高，這說明紋黨多糖能夠降低糖尿病大鼠糖化血紅蛋白水平。

表5　紋黨多糖對糖尿病大鼠糖化血紅蛋白含量的影響Table 5　Effect of CPP on HbAlc level in alloxan-induced diabetic rats

2.7紋黨多糖對糖尿病模型大鼠血脂代謝的影響

紋黨多糖對糖尿病大鼠血脂代謝的結(jié)果見表6。給藥28 d后，糖尿病模型大鼠TC、TG和HDL與空白組相比均極顯著升高（p＜0.01），而LDL極顯著降低（p＜0.01）；與模型組比較二甲雙胍組，TC、TG和HDL均顯著降低（p＜0.05），LDL顯著升高（p＜0.05）。紋黨多糖低劑量組與糖尿病模型組比較大鼠的TC、TG、HDL和LDL均無顯著差異（p＞0.05）；紋黨多糖中劑量組與糖尿病模型組比較大鼠的TC和TG極顯著降低（p＜0.01），HDL顯著降低（p＜0.05），LDL無顯著差異（p＞0.05）；紋黨多糖高劑量組與糖尿病模型組比較大鼠的TC、TG和HDL極顯著降低（p＜0.01），LDL極顯著升高（p＜0.05）。結(jié)果表明紋黨多糖可以調(diào)節(jié)糖尿病大鼠血脂。

表6　紋黨多糖對糖尿病大鼠血脂代謝的影響Table 6　Effect of CPP on serum lipid in alloxan-induced diabetic rats

2.8紋黨多糖對糖尿病模型大鼠體重的影響

紋黨多糖對糖尿病大鼠體重的影響見表7。在ALX誘導糖尿病模型組大鼠成功后3～4 d內(nèi)出現(xiàn)飲水、進食及尿量明顯增加，體質(zhì)量略有下降，活動減少等表現(xiàn)，空白組大鼠體重隨時推移而迅速增加，與模型組相比，在給藥第28 d后，紋黨多糖高、中、低治療組大鼠體重逐漸恢復增加，活動與精神狀況逐漸好轉(zhuǎn)，這可能是ALX誘導后糖尿病大鼠受到胰島素缺乏的原因，大鼠不能充分利用葡萄糖產(chǎn)生的能量，破壞了糖代謝的正常過程，而不能提供生理需要的能量，引起致脂肪和蛋白質(zhì)分解加速，消耗過量，體重逐漸下降。而通過紋黨多糖的治療，大鼠體重逐漸恢復。

表7　紋黨多糖對糖尿病大鼠體重（g）的影響Table 7　Effect of CPP on body weight（g）in alloxan-induced diabetic rats

2.9紋黨多糖對大鼠急性毒理實驗

大鼠口服（灌胃）急性毒性實驗中，一次性灌服紋黨多糖劑量分別為10000、20000、40000、60000 mg/ kg bw，給藥后籠邊觀察7 d，大鼠給藥后各組外觀毛色光亮，無興奮、不安、竄動、跳躍、豎毛、流淚、流涎、凸眼、扭體反應(yīng)現(xiàn)象，給藥后攝食、進水、大小便等均無明顯異常。觀察期間未出現(xiàn)死亡和異常反應(yīng)，大鼠活動自如。并對大鼠進行頸椎脫臼處死，進行重要臟器病理檢查，均未出現(xiàn)出血、充血、水腫、滲出、潰瘍、穿孔、胸腔、腹腔、心包膜無積液等明顯病理變化。根據(jù)毒理學評價標準，LD50＞10000 mg/kg bw屬于無毒性物質(zhì)［23］，本研究中一次性灌服紋黨多糖最大劑量為60000 mg/kg bw，遠遠大于毒理學評價標準，結(jié)果說明紋黨多糖對大鼠安全。

3　結(jié)論

糖尿病模型組大鼠的FBG明顯高于正常對照組；經(jīng)過28 d的灌胃治療，紋黨多糖治療組不同程度降低了大鼠的FBG，高劑量治療組的降糖效果顯著；紋黨多糖處理降低了大鼠糖化血紅蛋白含量，并且作用效果與二甲雙胍組接近；與空白組相比，糖尿病模型組大鼠TC和TG濃度顯著升高，HDL的含量有所下降，與糖尿病模型組相比，紋黨多糖各劑量組均能使糖尿病大鼠血清中TG、TC含量降低，同時提高HDL含量，說明能夠改善糖尿病大鼠血脂代謝紊亂的情況。本研究中一次性灌服紋黨多糖最大劑量為60000 mg/kg bw，遠遠大于毒理學評價標準，說明紋黨多糖對大鼠安全無毒。空白組大鼠體質(zhì)量隨時間推移增加迅速，與空白組相比較，造模成功后的各組大鼠體形則明顯消瘦，體重逐漸變輕，表明紋黨多糖具有很好的促進糖尿病大鼠體重恢復的作用。雖然紋黨多糖的降血糖作用不如口服降血糖藥二甲雙胍強烈，但其作用比較溫和，不會出現(xiàn)二甲雙胍那樣強烈的低血糖反應(yīng)。

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Effect of polysaccharides extract from Codonopisis pilosula on glycemia and lipidemia in alloxan-induced diabetic rats

YE Wen-bin，F(xiàn)AN Liang
（School of Agriculture and Forestry Technology，Longnan Teachers College，Longnan 742500，China）

The effects of polysaccharides from Codonopisis pilosula on glycemia and lipidemia in alloxan-induced diabetic rats were investigated in this study.The Sprague-Dawley rats were randomly divided into six groups：blank control group，positive control group（metformin group，glibenclamide group，epinephrine group），diabetic model group，and CPP-treated groups（low-，medium-，and high-dosage）.The CPP was continuous intragastric administration of polysaccharide 28 d，to investigated the effects of polysaccharides on blood glucose（FBG），glycosylated hemoglobin（HbAlc），total cholesterol（TC）triglyceride（TG），high density lipoprotein（HDL）and low density liporotein（LDL）in alloxan-induced diabetic rats.The results showed that the CPP could significantly（p＜0.01）reduced blood glucose in normal rats，could significantly reduced adrenaline induced hyperglycemia，could reduced the levels of FBG，HbAlc，TC and TG in serum in alloxan-induced diabetic rats，and increased the concentrations of HDL significantly.In summary，CPP had effects on decreasing the blood glucose and adjusting the disorder of lipid metabolism in alloxan-induced diabetic rats.

Codonopisis pilosula；polysaccharides；diabetes rats；hypoglycemia；blood lipid

TS201.4

A

1002-0306（2015）20-0359-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.065

2015－03－19

葉文斌（1982-），男，碩士，講師，研究方向：天然產(chǎn)物化學、果蔬保鮮及植物生理生態(tài)，E-mail：lnszywb@163.com。

國家“863”計劃項目（2006EA780088）；廣東省科技廳科技計劃項目（2007B080701046）；隴南師范高等專科學校重點科研項目（2014LSZK01001）。