添加復合發(fā)酵劑對發(fā)酵豬肉干食品安全性的影響

王新惠，張　崟，譚茂玲，李俊霞，白　婷，鄒　強，屈　瑤，蔣心茹（成都大學生物產業(yè)學院肉類加工四川省重點實驗室，四川成都610106）

添加復合發(fā)酵劑對發(fā)酵豬肉干食品安全性的影響

王新惠，張崟，譚茂玲，李俊霞，白婷，鄒強，屈瑤，蔣心茹
（成都大學生物產業(yè)學院肉類加工四川省重點實驗室，四川成都610106）

以清酒乳酸桿菌（Lactobacillus sakei）和木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）為復合發(fā)酵劑發(fā)酵豬肉干，研究復合發(fā)酵劑對發(fā)酵豬肉干腐敗微生物生長增殖、組胺積累、亞硝酸鹽殘留、脂質氧化及揮發(fā)性氨基氮（TVB-N）生成的影響。結果表明：接種復合發(fā)酵劑顯著（p＜0.05）抑制發(fā)酵過程中大腸桿菌、李斯特菌、假單胞菌和金黃色葡萄球菌等腐敗微生物的生長增殖；發(fā)酵結束時，添加復合發(fā)酵劑和自然發(fā)酵組的組胺含量分別為0.32和8.85 mg/kg，亞硝酸鈉殘留量分別為8.95和45.6 mg/kg，硫代巴比妥酸（TBA）值分別為0.67和1.54 mg MDA/kg，TVB-N含量分別為1.23和5.25 mg/100 g。添加復合發(fā)酵劑組的組織狀態(tài)、風味和色澤等感官評分均高于自然發(fā)酵組，獲得了優(yōu)良的感官特性。

清酒乳酸桿菌，木糖葡萄球菌，發(fā)酵豬肉干，組胺，亞硝酸鹽，脂質氧化

發(fā)酵肉干營養(yǎng)豐富、風味獨特、耐貯存、食用方便，是餐桌上的一道佳肴，也是旅游休閑時常備食品之一。我國發(fā)酵肉干主要采用自然發(fā)酵，存在諸多食品安全問題，主要表現(xiàn)如下：自然發(fā)酵初期由于優(yōu)勢菌群未形成，大腸桿菌、假單胞菌等腐敗微生物的滋生極易造成肉干的腐敗。原料肉富含蛋白質和氨基酸，在自然發(fā)酵過程中，其游離氨基酸易被具氨基酸脫羧酶的雜菌轉化為生物胺。研究表明，食品中組胺超過100 mg/kg，酪胺超過100 mg/kg將導致食物中毒［1］。亞硝酸鈉作為一種傳統(tǒng)的發(fā)色劑、防腐劑和抗氧化劑在發(fā)酵肉干生產中被廣泛使用。亞硝酸鹽是食品添加劑中急性毒性較強的物質之一，且亞硝酸鹽可與次級胺結合，形成亞硝胺，從而誘發(fā)消化系統(tǒng)癌變，是影響發(fā)酵肉干食品安全性的重要因素之一［2］。發(fā)酵肉干油脂比較高，在發(fā)酵過程中易發(fā)生脂質氧化，出現(xiàn)酸敗現(xiàn)象。

目前，歐美國家已采用微生物發(fā)酵技術生產具有特殊風味、營養(yǎng)、高質量的發(fā)酵肉干。清酒乳酸桿菌（Lactobacillus sakei）是歐洲常用的肉制品發(fā)酵劑，該菌株產乳酸賦予肉制品特有的發(fā)酵風味，由于產乳酸使肉制品在發(fā)酵初期pH迅速下降和產乳酸菌素，從而抑制李斯特菌（Listeria monocytogenes）、大腸桿菌（Escherichia coli）等食源性致病菌生長增殖［3］。此外，清酒乳酸桿菌具有亞硝酸還原酶，促進亞硝酸鹽的分解，降低肉制品中亞硝酸鹽殘留。木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）是目前歐洲發(fā)酵肉制品常用的發(fā)酵劑，該菌具有胺氧化酶、超氧化歧化酶、蛋白酶和脂酶，對改善肉制品的風味、降解生物胺以及抗脂質氧化起到至關重要的作用［4］。若能采用清酒乳酸桿菌和木糖葡萄球菌復合發(fā)酵，則可抑制腐敗微生物生長、減少生物胺積累和亞硝酸鹽殘留等提高發(fā)酵肉干的食品安全性。因此，本文以清酒乳酸桿菌和木糖葡萄球菌為復合發(fā)酵劑，以豬肉為基質，生產休閑發(fā)酵豬肉干，研究復合發(fā)酵劑對發(fā)酵豬肉干腐敗微生物生長增殖、組胺積累、亞硝酸鹽殘留、脂質氧化及揮發(fā)性氨基氮（TVB-N）生成的影響，以期為改善傳統(tǒng)發(fā)酵豬肉干質量和食品安全性提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

清酒乳酸桿菌（Lactobacillus sakei）和木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus） 均購于廣東省微生物菌種保藏中心（GIMCC）；新鮮豬肉、調味品和香辛料購于家樂福四川成都市新都連鎖店；亞硝酸鈉、磷酸氫二鉀、異抗壞血酸、硼酸、碳酸鉀、甲基藍、甲基紅、鹽酸、硫代巴比妥酸（TBA）、三氯乙酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、高氯酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、丹酰氯、磷酸組胺、硼砂、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺均為分析純，購于上海化學試劑總廠；豬肉干配方［5］鹽20 g/kg，蔗糖3 g/kg，亞硝酸鈉150 mg/kg，異抗壞血酸0.3 g/kg，復合磷酸鹽0.3 g/kg，味精0.2 g/kg，白胡椒粉1 g/kg，料酒2 g/kg。

SH-020型恒溫恒濕發(fā)酵箱上海上器集團實驗設備有限公司；LRH-250F型生化培養(yǎng)箱上海一恒科學儀器有限公司；DNY-Ⅱ型全自動凱氏定氮儀山東濰坊普創(chuàng)儀器有限公司；BYXX-50型烤箱深圳奈美特工業(yè)設備有限公司；DZ500/2SB型真空包裝機浙江葆春包裝機械總廠；TGL-20M型高速臺式冷凍離心機湖南湘儀離心機儀器有限公司；VE-AS型超純水機深圳沃爾奇環(huán)保股份有限公司；XW-80A型漩渦混合器上海精科實業(yè)有限公司；KH5200DE型數控超聲波清洗器北京金科利達電子科技有限公司；UV741型可見紫外分光光度計惠普上海分析儀器有限公司；JA2003型電子天平上海天平儀器廠；HH-2型恒溫水浴鍋浙江金壇梅香儀器設備有限公司；VOSHIN-600R型均質器江蘇無錫沃信儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1工藝流程原料肉→切塊→去腥→漂洗→加復合磷酸鹽→腌制→拌料→直投發(fā)酵劑→發(fā)酵→烘烤→冷卻→真空包裝→成品［5］。

1.2.2操作要點選用檢驗合格的市售精瘦肉，剔除骨、筋膜以及脂肪以后，用清水漂洗；切成3 cm× 1.5 cm×0.5 cm的肉片，肉片長度方向順著豬肉纖維的方向，洗凈后瀝凈血水，將肉片在30℃溫水中浸泡30 min，去掉血水和泡沫；在切好的肉片中加入磷酸復合鹽，攪拌均勻，4℃腌制24 h后添加香辛料和輔助材料，混勻，4℃腌制2 h［5］；將清酒乳酸桿菌和木糖葡萄球菌凍干菌劑（1∶1）直投肉片中，接種量0.2%（W∶W），混合均勻，放置發(fā)酵箱中28℃，相對濕度90%～95%發(fā)酵36 h［5］，以自然發(fā)酵為對照；發(fā)酵結束后，將肉片均勻地攤在烘篩上，60～65℃烘烤4～5 h［5］，期間定期翻轉肉片使之受熱均勻；取出烘烤成熟后的肉干，放置室溫冷卻，然后包裝。

1.3測定方法

1.3.1菌落數測定依據GB/T4789.5-2012《食品衛(wèi)生微生物學檢驗》［6］的檢測方法，測定發(fā)酵結束時發(fā)酵肉中的大腸桿菌、李斯特菌、假單胞菌和金黃色葡萄球菌的菌落數。

1.3.2亞硝酸鹽測定依據GB/T5009.33-2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》［7］的檢測方法，測定發(fā)酵肉干中亞硝酸鹽的含量。

1.3.3組胺測定采用高效液相色譜法測定組胺含量［8］。稱取5 g樣品，置于具塞離心管中，加入0.4 mol/L高氯酸溶液，均質1 min，6000 r/min離心5 min。取上清液2 mL，置于10 mL離心管中，依次加入100 μL 2 mol/L氫氧化鈉溶液，300 μL飽和碳酸氫鈉溶液和1 mL 10 mg/mL丹酰氯溶液，蓋塞。40℃避光反應45 min，反應完畢后，定容至5 mL，振蕩均勻，0.20 μm濾膜過濾，用于分析檢測。柱溫35℃，流動相流速0.3 mL/min，進樣量50 μL。

1.3.4硫代巴比妥酸（TBA）值測定參考孫群［9］的方法測定發(fā)酵肉干的TBA值。

1.3.5TVB-N測定參考蔣立鳳等［10］的方法測定發(fā)酵肉干的TVB-N值。

1.4感官評定

由21位感官評定人員進行感官評定。將樣品進行隨機編號，然后分發(fā)給感官評定小組成員。小組成員根據SB/T10282-2007對樣品的色澤、風味和組織狀態(tài)進行評分，評分標準見表1。

表1　發(fā)酵豬肉干感官評分標準Table 1　Sensory estimation standard of fermented pork jerky

1.5數據處理與統(tǒng)計分析

數據統(tǒng)計分析，采用SAS軟件（SAS Institute，2000）的ANOVA進行分析，采用普通線性模型（GLM）計算，用最小顯著性差異檢驗平均值間的差異，設定5%為顯著性差異水平。對每次實驗的每個樣品做三次重復測定。

2　結果與分析

2.1復合發(fā)酵劑對腐敗微生物生長的影響

發(fā)酵結束時，發(fā)酵肉干原料肉中微生物菌落數如圖1所示。接種復合發(fā)酵劑顯著抑制大腸桿菌和假單胞菌的生長增殖，其菌落數均＜2 log10（CFU）/g，未檢測出單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌。自然發(fā)酵組中大腸桿菌、李斯特菌、假單胞菌和金黃色葡萄球菌的菌落數分別為4.32、3.25、3.98和1.54 log10（CFU）/g，根據GB 2726-2005《熟肉制品衛(wèi)生標準》［11］，自然發(fā)酵組中單增李斯特菌和假單胞菌均超標。結果表明，復合發(fā)酵劑組的腐敗微生物顯著下降（p＜0.05），這可能由于接種復合發(fā)酵劑，使清酒乳酸桿菌和木糖葡萄球菌在發(fā)酵初期迅速成為優(yōu)勢菌，清酒乳酸桿菌產乳酸使發(fā)酵肉的pH快速下降，從而加速大腸桿菌、李斯特菌、假單胞菌和金黃色葡萄球菌的消亡，另外清酒乳酸桿菌可產生細菌素，抑制大腸桿菌、李斯特菌、假單胞菌和金黃色葡萄球菌的生長［1，8］。

圖1　發(fā)酵結束時接種復合發(fā)酵劑和自然發(fā)酵組中的微生物菌落數Fig.1　Effect of inoculation with a starter culture composed of Lactobacillus sakei and Staphylococcus xylosu on the growth of spoilage microorganisms in fermented pork jerky at the end of fermentation

2.2復合發(fā)酵劑對發(fā)酵過程中組胺含量的影響

復合發(fā)酵劑對發(fā)酵過程中發(fā)酵肉干組胺含量的影響如圖2所示。發(fā)酵24 h前接種復合發(fā)酵劑和自然發(fā)酵組中的組胺含量均呈上升趨勢，發(fā)酵24 h時組胺含量分別為7.19和15.79 mg/kg。發(fā)酵后期，接種復合發(fā)酵劑和自然發(fā)酵組中的組胺含量逐漸下降，發(fā)酵結束時組胺含量分別降至0.32和8.85 mg/kg。結果表明，接種復合發(fā)酵劑與肉干發(fā)酵過程中的組胺含量呈負相關性，肉干中的組胺含量顯著降低（p＜0.05），比自然發(fā)酵組降低96.2%，這可能是由于復合發(fā)酵劑抑制組胺產生菌的生長，從而降低肉制品中組胺的含量。發(fā)酵食品中組胺的形成主要源于污染的雜菌如大腸桿菌屬、假單胞菌屬微生物。Gardini等［12］研究表明，木糖葡萄球菌具有較強胺氧化酶，催化生物胺降解生成醛、過氧化氫和氨，降低肉制品中組胺含量，這可能是接種復合發(fā)酵劑組發(fā)酵后期組胺顯著減少的原因。

圖2　接種復合發(fā)酵劑和自然發(fā)酵組發(fā)酵過程中組胺含量變化情況Fig.2　Changes in histamine accumulation in sample inoculated with a starter culture composed of Lactobacillus sakei and Staphylococcus xylosu during fermentation

圖3　接種復合發(fā)酵劑和自然發(fā)酵組發(fā)酵過程中亞硝酸鹽殘留量變化情況Fig.3　Effect of inoculation with a starter culture composed of Lactobacillus sakei and Staphylococcus xylosu on nitrite depletion in fermented pork jerky during fermentation

2.3復合發(fā)酵劑對發(fā)酵過程中亞硝酸鹽殘留量的影響

由圖3可知，接種復合發(fā)酵劑和自然發(fā)酵組在發(fā)酵過程中亞硝酸鈉殘留量均呈下降趨勢。發(fā)酵初期，亞硝酸鈉殘留量下降較緩慢，發(fā)酵12 h后亞硝酸鈉殘留量下降趨勢增大，且接種復合發(fā)酵劑組下降幅度高于自然發(fā)酵組（p＜0.05）。發(fā)酵結束時，接種復合發(fā)酵劑和自然發(fā)酵組中的亞硝酸鈉殘留量分別為8.95和45.6 mg/kg，亞硝酸鈉降解率分別為94.1%和69.6%。實驗結果表明，復合發(fā)酵劑組在發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量顯著下降（p＜0.05），成品中亞硝酸鹽殘留量為9.21 mg/kg（＜30 mg/kg），符合肉干衛(wèi)生標準。Honikel等［13］研究表明，清酒乳酸桿菌、植物乳酸桿菌等乳酸菌屬具有亞硝酸鹽還原酶，可催化NO2-還原生成NO和N2O，而NO和N2O與肌紅蛋白結合，形成穩(wěn)定的鮮紅色，起到促色作用。Cardini等［12］報道木糖葡萄球菌過氧化氫酶，能夠將亞硝酸鹽分解成氨。這可能是接種復合發(fā)酵劑組亞硝酸鈉顯著降解的原因。

圖4　復合發(fā)酵劑對發(fā)酵過程中發(fā)酵豬肉干脂質氧化的影響Fig.4　Effect of inoculation with a starter culture composed of Lactobacillus sakei and Staphylococcus xylosu on lipid oxidation in fermented pork jerky during fermentation

2.4復合發(fā)酵劑對發(fā)酵過程中肉干脂質氧化的影響

由圖4可知，接種復合發(fā)酵劑和自然發(fā)酵組在發(fā)酵過程中硫代巴比妥酸（TBA）值均呈上升趨勢，接種復合發(fā)酵劑組與自然發(fā)酵組的TBA值差異顯著（p＜0.05）。發(fā)酵結束時，接種復合發(fā)酵劑和自然發(fā)酵組的TBA值分別為0.67和1.54 mg MDA/kg，接種復合發(fā)酵劑組比自然發(fā)酵組的TBA值降低56.5%。脂肪氧化可產生風味前體物質，但過度氧化會產生毒素，危害人體健康。脂質氧化程度是衡量肉制品品質優(yōu)劣的重要指標之一。Martuscelli等［14］報道乳酸菌屬、葡萄球菌屬和片球菌屬等能分解蛋白質生成抗氧化肽，起到抗氧化作用。Bover-Cid等［15］研究表明，木糖葡萄球菌具有超氧化歧化酶，可抑制肉制品的脂質氧化。這可能是接種復合發(fā)酵劑組脂質氧化顯著受到抑制的原因。

圖5　復合發(fā)酵劑對發(fā)酵過程中肉干TVB-N含量的影響Fig.5　Effect of inoculation with a starter culture composed of Lactobacillus sakei and Staphylococcus xylosu on TVB-N content in fermented pork jerky during fermentation

2.5復合發(fā)酵劑對發(fā)酵過程中肉干揮發(fā)性鹽基氮含量的影響

由圖5可知，發(fā)酵過程中接種復合發(fā)酵劑組中揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量與自然發(fā)酵組差異顯著（p＜0.05）。發(fā)酵初期，自然發(fā)酵組TVB-N含量迅速增加，而接種復合發(fā)酵劑組TVB-N含量增加緩慢；發(fā)酵24 h后，接種復合發(fā)酵劑和自然發(fā)酵組TVB-N含量變化均趨于穩(wěn)定；發(fā)酵結束時，接種復合發(fā)酵劑和自然發(fā)酵組TVB-N含量分別為1.23和5.25 mg/100 g，自然發(fā)酵組的TVB-N含量是接種復合發(fā)酵劑組的4.27倍。TVB-N通常作為衡量蛋白性食品新鮮度的理化指標，它與食品的腐敗有很密切的關系，TVB-N值隨肉品腐敗程度加深而增加，肉品中TVB-N主要是由大腸桿菌、假單胞菌等腐敗微生物分解蛋白質而生成［16］。結果表明，接種復合發(fā)酵劑組TVB-N含量顯著低于自然發(fā)酵組（p＜0.05），這一結果與大腸桿菌、假單胞菌菌落數測定結果相符。

2.6復合發(fā)酵劑對發(fā)酵豬肉干感官評價的影響

發(fā)酵結束肉干烘干后，對組織狀態(tài)、風味和色澤等進行感官評定，結果如表2所示。添加復合發(fā)酵劑組的組織狀態(tài)、風味和色澤評分均高于自然發(fā)酵組。木糖葡萄球菌產蛋白酶，促進蛋白質降解產生小肽和游離氨基酸，這些物質不僅是發(fā)酵肉干中的重要滋味物質，且它們參與后續(xù)化學反應如美拉德反應產生的香味物質往往是發(fā)酵肉制品的特征風味物質。清酒乳酸桿菌產生乳酸，降低產品的pH，有利于蛋白質的凝結，賦予了產品良好的組織狀態(tài)，同時提高了產品的風味和彈性。這可能是添加復合發(fā)酵劑賦予發(fā)酵豬肉干良好的風味、色澤和口感等的主要原因。

表2　接種復合發(fā)酵劑和自然發(fā)酵肉干的感官評價Table 2　The sensory evaluation in fermented pork jerky inoculated with starter culture and by a spontaneous fermentation

3　結論

清酒乳酸桿菌與木糖葡萄球菌復配用于生產發(fā)酵豬肉干，發(fā)酵過程中接種復合發(fā)酵劑組中的大腸桿菌、假單胞菌的生長受到顯著抑制，未檢測出李斯特菌和金黃色葡萄球菌。接種復合發(fā)酵劑與自然發(fā)酵相比，發(fā)酵結束時組胺含量降低96.2%，亞硝酸鹽殘留量降低80.4%，TBA值降低56.5%，TVB-N含量降低76.6%，發(fā)酵豬肉干獲得良好的風味、色澤和口感。

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Effect of inoculation with a starter culture composed of Lactobacillus sakei and Staphylococcus xylosus on the food safety of fermented pork jerk

WANG Xin-hui，ZHANG Yin，TAN Mao-ling，LI Jun-xia，BAI Ting，ZOU Qiang，QU Yao，JIANG Xin-ru
（Meat-processing Key Laboratory of Sichuan，F(xiàn)aculty of Biotechnology industry，Chengdu 610106，China）

Effect of inoculation with a starter culture composed of Lactobacillus sakei and Staphylococcus xylosus on the growth of pathogenic bacteria，histamine reduction，nitrite depletion，oxidative stability and levels of TVB-N in fermented pork jerky were evaluated.Results showed that inoculation with the starter culture was against the growth of meat-spoiling microorganisms，namely Escherichia coli，Listeria monocytogenes，Pseudomonas and Staphylococcus aureus.At the end of fermentation，the levels of histamine were 0.32 and 8.85 mg/kg in the fermented pork jerky inoculated with starter culture and by a spontaneous fermentation，respectively.The levels of residual nitrite dropped rapidly from 150 to 8.95 mg/kg in the fermented pork jerky inoculated with starter culture while 45.6 mg/kg nitrite was detected at the end of fermentation in the sample by a spontaneous fermentation.The thiobarbituric acid reactive substances test（TBARS）values were 0.67 and 1.54 mg MDA/kg in the fermented pork jerky inoculated with starter culture and by a spontaneous fermentation，respectively.The levels of TVB-N were 1.23 and 5.25 mg/100g in the fermented pork jerky inoculated with starter culture and by a spontaneous fermentation，respectively.The organization appearance，taste，smell and color of sensory scores in sample inoculated with starter cultures were higher than that of control，and exhibited good sensory properties.

Lactobacillus sakei；Staphylococcus xylosus；fermented pork jerky；histamine；nitrite；lipid oxidation

TS201.1

A

1002-0306（2015）20-0234-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.041

2014－12－16

王新惠（1982-），女，博士，副教授，主要從事肉類加工及質量控制方面的研究，E-mail：wangxinhui19820319@163.com。

四川省教育廳川菜發(fā)展研究中心項目（CC14Z05）；國家自然科學基金資助項目（31301552）；成都大學大學生創(chuàng)新性實驗項目（CDUCX-2014012）。