單親滅活保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株融合子的選育

王慕華，潘佩平，趙玉明，2，蘇檳楠，蔡穎慧，李海濤，2（.山西省生物研究所，山西太原030006；2.山西維爾生物乳制品有限公司，山西太原030006）

單親滅活保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株融合子的選育

王慕華1，潘佩平1，趙玉明1，2，蘇檳楠1，蔡穎慧1，李海濤1，2
（1.山西省生物研究所，山西太原030006；2.山西維爾生物乳制品有限公司，山西太原030006）

為獲得具有抗噬菌體功能且發酵性能優良的乳酸菌酸奶生產菌株，將生產用保加利亞乳桿菌制備原生質體后高溫滅活，滅活后的原生質體與嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株的原生質體通過PEG6000誘導進行融合，并對融合子性能進行研究。結果從20株融合子中挑選出3株具有噬菌體抗性且發酵性能優良的乳酸菌融合子。融合條件為：以PEG6000（濃度為400 g/L，添加0.01 mol/L CaCl2、0.02 mol/L MgCl2）為促融劑，40℃融合2 min。此條件下，融合率可達1.85×10-6。獲得的融合子在凝乳、產酸、產粘性物質、產香氣成分及抗噬菌體方面性能優越，適合于酸奶生產。

單親滅活，保加利亞乳桿菌，嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株，原生質體融合，融合子選育

被譽為“美味食品”的酸奶因具有減緩人體乳糖不耐受性、減輕便秘、增強機體免疫力、降低血清膽固醇等功能而廣受關注，需求量不斷增大［1］。隨著需求的增加，乳制品企業生產規模的擴大，生產菌株性能不穩定、常受噬菌體污染等問題也就日益凸顯出來［2-3］。在發酵工業中，抗噬菌體乳酸菌的選育對于提高發酵效率，改善產品風味等起著非常重要的作用［4］。在發達國家，評價或篩選發酵劑優良菌株的重要標準就是抗噬菌體特性［5］，目前我國在抗性乳酸菌的研究方面還停留在菌株的初步選育階段，在工業化生產中應用很少，其生物學特性及發酵穩定性有待于進一步研究。

酸奶發酵通常采用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為主要發酵菌株。傳統上，研究者普遍認為嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌存在互惠共生關系［6］。這兩種菌在牛奶中混合發酵會提高產酸速度，減弱后酸化程度，促進風味物質產生，產生更多的胞外多糖［7-8］。但近年來也有研究表明，某些嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌株之間也存在拮抗抑制作用［9］，混合發酵時比例不合適、條件控制不當就會直接影響到酸奶的生產時間與質量。因而研究嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌菌株之間的共生關系，進行抗噬菌體菌株的選育，實現優良性狀發酵菌株與抗噬菌體菌株的融合，可為工業化生產篩選出性狀優良且質量穩定的酸奶生產菌株。與傳統誘變或基因工程菌相比，原生質體融合可集中雙親優良性狀且遺傳穩定、安全可靠［10］。常用的合胞體雜種鑒定的方法有：菌體形態、大小等方面的形態特征分析；染色體核型、DNA含量、分子雜交等方面的遺傳物質分析；同功酶譜、酶活性測定等方面的生理特性分析等［11］。本實驗通過將已有的嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株與具有優良生產性狀的保加利亞乳桿菌進行融合，以期篩選出適合酸奶生產的乳酸菌生產菌株。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株（Streptococcus thermophilus，S.t）由本所選育、保藏；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus，L.b）酸奶生產廠家提供，本所保藏；噬菌體3種噬菌斑形態不同的噬菌體混合液，由本所分離、保藏［12］；牛奶山西維爾生物乳制品有限公司提供，食品級；溶菌酶（22800 U/mg）BBI 購于生工生物工程（上海）有限公司；其他常規試劑均為國產分析純。

PHS-3C雷磁pH計上海精密科學儀器有限公司；NDJ-1型旋轉黏度計上海天平儀器廠；SLJ-Ⅰ型離心機沈陽理化儀器廠；WS2-84-64手提式高壓蒸汽消毒器上海醫用核子儀器廠；722PC可見分光光度計上海佑科儀器儀表有限公司；WS2-134-75電熱恒溫培養箱連云港醫療器械設備廠；FA1004電子天平上海舜宇恒平科學儀器有限公司；XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋北京市永光明醫療儀器廠；JT-型超凈工作臺常州第二航海儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1試劑及培養基配制高滲溶液（原生質體穩定液）：10 mmol/L Tris-HCl中加入0.5 mol/L蔗糖和0.02 mol/L MgCl2，用4 mol/L HCl溶液調節pH至6.5。

聚乙二醇（PEG6000）：高滲溶液配制為400 g/L，并向其中加入0.01 mol/L CaCl2、0.02 mol/L MgCl2。

溶菌酶液：高滲溶液配制為10 mg/mL的酶原液，現用現配，過濾除菌。

MRS培養基［13］：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，蒸餾水1000 mL，pH6.2～6.4，固體培養基添加1.5%的瓊脂，用于保加利亞乳桿菌的培養。

M17培養基［13］：植物蛋白胨5.0 g，聚蛋白胨5.0 g，酵母提取物5.0 g，牛肉浸膏2.5 g，抗壞血酸0.5 g，β-甘油磷酸二鈉19.0 g，1.0 mol/L MgSO4·7H2O 1.0 mL，蒸餾水1000 mL，pH6.8，固體培養基添加1.5%的瓊脂，用于嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株的培養。

原生質體再生培養基［14］：MRS、M17再生培養基為在其原有配方的基礎上添加0.5 mol/L蔗糖，0.02 mol/L MgCl2。

脫脂乳培養基：牛乳脫脂后115℃滅菌15 min，冷卻后置于冰箱冷藏備用，用于菌種的活化和菌株發酵性能的研究。

1.2.2指標檢測

1.2.2.1噬菌體效價測定采用雙層瓊脂平板法［15］。

1.2.2.2酸奶酸度測定按GB/T 5409-85中滴定酸度的測定方法。

1.2.2.3pH測定采用酸度計于室溫測定。

1.2.2.4粘度測定采用旋轉粘度計，取牛乳發酵后4℃冷藏12 h的樣品進行測定。

1.2.2.5乙醛含量測定乙醛在酸性條件下與亞硫酸氫鈉發生加成反應生成乙醛亞硫酸氫鈉，其剩余的亞硫酸氫鈉被碘氧化。在堿性條件下，乙醛亞硫酸氫鈉與碘定量反應，根據當量關系計算乙醛含量［16］。

1.2.2.6發酵活力測定酸度測定法：向滅菌脫脂乳中加3%發酵劑（菌體牛乳培養物），在適宜溫度下（42℃）培養3.5 h，滴定其酸度。以乳酸酸度值來表示發酵活力，具體測定步驟如下：稱取10 g（精確到0.001 g）已混勻的試樣，置于150 mL錐形瓶中，加20 mL新煮沸冷卻至室溫的水，混勻，用氫氧化鈉標準溶液電位滴定至pH8.3為終點；或于溶解混勻后的試樣中加入2.0 mL酚酞指示液，混勻后用氫氧化鈉標準溶液滴定至微紅色，并在30 s內不褪色，記錄消耗的氫氧化鈉標準滴定溶液毫升數，代入下面公式中進行計算。結果以兩次平行實驗的平均值表示。

式中：X—試樣的酸度，°T；c—氫氧化鈉標準溶液的摩爾濃度，mol/L；V—滴定時消耗氫氧化鈉標準溶液體積，mL；m—試樣的質量，g；0.1—酸度理論定義氫氧化鈉的摩爾濃度，mol/L；0.009—相當于乳酸（90%）的量。

1.2.3保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株的培養將菌株從保存管中取出，以3%的接種量接種于脫脂乳培養基中，嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株42℃培養4～6 h，保加利亞乳桿菌40℃培養10～12 h，連續活化2代。菌種活化后，嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株接入M17液體培養基中，42℃培養10 h；保加利亞乳桿菌接入MRS液體培養基中，40℃培養12 h。

1.2.4保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株的原生質體制備保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株培養到對數期后，收集菌體。30 mL高滲溶液洗滌2次后，15 mL高滲溶液懸浮，以溶菌酶作為去壁酶系進行原生質體的制備，酶解后再用15 mL高滲溶液懸浮得原生質體液。原生質體制備條件如表1。

表1　保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株原生質體制備條件Table 1　Protoplast preparation conditions of Lactobacillus bulgaricus and the bacteriophage-resistant mutants of Streptococcus thermophilus

1.2.5保加利亞乳桿菌的原生質體滅活保加利亞乳桿菌原生質體液于60℃水浴中恒溫滅活50 min，取滅活前與滅活后的原生質體液適當稀釋后涂MRS再生培養基平皿，40℃培養3～5 d后計數。

式中：A1為滅活前長出的菌落數；A2為滅活后長出的菌落數。

1.2.6保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株的原生質體融合滅活的保加利亞乳桿菌原生質體液與嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株原生質體液等量混合，取樣分別涂M17、M17再生平皿，混合后放置5 min，2500 r/min離心10 min，收集原生質體，于沉淀中加入0.2 mL高滲溶液充分懸浮，再加入1.8 mL PEG6000溶液，混勻后分別于30、35、40、45℃處理1、2、5、10 min，2500 r/min離心10 min后懸浮于2 mL高滲溶液中，將懸浮液適當稀釋后涂MRS再生平皿。M17平皿42℃，培養48 h后計數；M17、MRS再生平皿42℃，培養3～5 d后計數。

式中：D為融合子數，即融合后在MRS再生培養基上長出的菌落數；E為融合前在M17再生培養基上長出的菌落數；F為融合前在M17培養基上長出的菌落數。

1.2.7融合子的抗噬菌體性能檢測

1.2.7.1融合子的噬菌體抗性檢測采用雙層瓊脂平板法進行檢測［12］：噬菌體增殖液（濃度為109PFU/mL）稀釋到10-4，取稀釋液0.1 mL和融合子的MRS培養液0.3 mL于20 mL滅菌小三角瓶中，再加入50℃左右的上層培養基，混勻后倒雙層平板，42℃培養48 h后觀察有無噬菌斑出現。

1.2.7.2融合子的抗噬菌體穩定性檢測融合子抗噬菌體能力的穩定性通過傳代穩定性實驗來驗證［12］：將獲得的融合子以3%接種量在牛乳培養基中傳代15代，取第5、10、15代以雙層瓊脂平板法檢測有無噬菌斑出現；將融合子以3%接種量與噬菌體增殖液（109PFU/mL）在牛乳培養基中共同傳代15代，觀察牛乳的凝固情況。

1.2.7.3融合子的溶源性檢測將篩選出來的融合子以3%接種量接種到MRS培養基中，1 h后加入0.4 ng/mL的絲裂霉素（mmc）誘導，繼續培養，16 h后向菌液中加幾滴氯仿劇烈振蕩、3500 r/min離心15 min，取上清液做雙層平板檢查，觀察有無噬菌斑出現［12］。

1.2.8融合子發酵性能的初步篩選測定將所獲得的遺傳穩定的融合子分別以3%的接種量接入150 mL滅菌牛乳中，42℃培養，每隔2 h測定其活菌數及pH。發酵結束后，統計融合子的凝乳時間、粘度、乙醛含量及滴定酸度，并測定融合子的發酵活力。

1.2.9融合子在高噬菌體環境下的發酵性能測定將初步鑒定生長、發酵性能優越的融合子與敏感菌株以3%的接種量接入150 mL滅菌牛乳中，向其中加入最佳感染復數（0.01）的噬菌體，每2 h測定其活菌數及pH，待發酵結束后，測定粘度、乙醛含量、凝乳時間并滴定酸度，結合感官評價挑選優良抗性菌株。感官評價方法為：10位食品研究人員品嘗，并描述產品的口感、滋氣味、乳清析出、組織狀態等感官性狀；氣味在封蓋打開后馬上檢測，乳清析出通過觀察凝乳表面評定，組織狀態用勺子在凝乳中輕輕攪拌均勻后觀察；根據描述撰寫感官風味評價。

1.2.10融合子Rh6的富集培養培養選用MRS培養基，培養過程中以Na2HPO4-檸檬酸（pH6.5）為緩沖液，42℃靜置培養，每隔2 h晃動并取樣測定其活菌數及pH。

1.3數據處理與統計分析

所有測定數據，采用Office Excel 2003（美國微軟公司）整理、繪圖，采用SPSS19.0軟件（美國IBM）統計分析，數值以均值±標準差表示。

2　結果與討論

2.1保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株的培養及原生質體制備

嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株培養10 h進入對數生長期，保加利亞乳桿菌培養12 h進入對數生長期，菌體量均可達109CFU/mL。按表1的原生質體制備條件，保加利亞乳桿菌的原生質體形成率為91.5%± 2.62%，嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株的原生質體形成率為99.15%±0.23%。

2.2保加利亞乳桿菌的原生質體滅活

保加利亞乳桿菌原生質體液于60℃水浴中恒溫滅活50 min，滅活率為98.64%±1.33%。

2.3滅活保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株原生質體融合條件的確定

滅活保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株的原生質體進行融合，在高滲溶液中由PEG6000促融，融合溫度及融合時間對融合率的影響如圖1所示。

圖1　融合溫度和融合時間對原生質體融合率的影響Fig.1　Effect of temperature and time on protoplast fusion rate

由圖1可知，原生質體融合時，時間不宜太長，這可能與融合時PEG6000會對原生質體造成一定的損傷有關［17］。最佳融合條件為：40℃，融合2 min，此條件下，融合率為1.85×10-6。

2.4融合子的檢出及融合子的菌體形態

保加利亞乳桿菌可以在MRS、M17培養基上生長，而本實驗用到的嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株在MRS培養基上非厭氧培養時不生長，融合前保加利亞乳桿菌原生質體幾乎全部滅活，因而可以認為融合后在MRS再生平皿上普通培養時生長的菌落即為融合子。將融合后再生于原生質體再生培養基上的20株菌的菌落標記并接入牛乳培養基中保存。通過凝乳時間檢測挑選出3株凝乳較快的融合子，分別命名為Rh1、Rh6、Rh9，其中以Rh6凝乳最快，其菌體形態如圖2所示，融合子Rh6呈橢圓形近似短桿，而出發菌株保加利亞乳桿菌為長桿狀，嗜熱鏈球菌為圓形。

圖2　融合前后菌體形態（×1000）Fig.2　Micrographs of Lactobacillus bulgaricus（A），the bacteriophage-resistant mutants of Streptococcus thermophilus（B）and their fusants（C）（×1000）

2.5融合子的抗噬菌體性能檢測

對篩選到的3株性能優良的融合子進行抗噬菌體能力檢測，采用雙層瓊脂平板法42℃培養48 h后觀察均無噬菌斑出現，說明3株融合子對噬菌體具有抗性。進行溶源性檢測，結果發現3株融合子所對應的雙層平板上都沒有噬菌斑出現，說明此3株融合子為非溶源菌。進行傳代穩定性實驗，結果為在第5、10、15代時都沒有噬菌斑出現，且融合子以3%接種量與噬菌體增殖液（109PFU/mL）在牛乳培養基中共同傳代，到第15代時仍可實現牛乳的正常凝固。說明融合子的抗噬菌體能力在遺傳上是穩定的。

篩選到的融合子非厭氧培養時可以在MRS培養基上生長且具有噬菌體抗性，菌體形態有別于出發菌株保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株，因此雖未作遺傳物質方面的深入研究，但從融合子的生長特征、形狀大小等表觀特征看，確為區別于雙親的融合子。

2.6融合子發酵性能初步測定

對具有遺傳穩定性的3株融合子進行發酵性能初步測定。每隔2 h在無菌的環境下取發酵樣本，測定融合子的活菌數及pH，結果如圖3、圖4所示。

圖3　融合子發酵過程活菌數Fig.3　The number of fusant in the fermentation process

圖4　融合子發酵過程pHFig.4　The pH in the fermentation process

由圖3可見，Rh6生長較快，Rh1、Rh9相對較緩慢。由圖4可知，Rh6的產酸能力較好。因此，初步判斷Rh6較適宜發酵生產。

發酵結束后，統計融合子的凝乳時間、粘度、乙醛含量及滴定酸度，并測定融合子的發酵活力，結果如表2所示。

表2　融合子發酵結果（平均值±標準偏差）Table 2　The fermentation results of fusants（mean±SD）

由表2可知，Rh6的各項性能比較優越，綜合以上融合子的特性及發酵能力，初步篩選出Rh6做進一步的研究，它的抗性穩定，生長能力、產酸能力較強，凝乳時間較短，粘度及乙醛含量較高，比較適合發酵生產。

2.7融合子在高濃度噬菌體條件下的發酵實驗

對融合子Rh6及通常酸奶發酵時使用的保加利亞乳桿菌L.b與嗜熱鏈球菌S.t的混合發酵劑進一步在高濃度噬菌體條件下（噬菌體濃度為109PFU/mL）進行牛乳發酵，測定各項指標。

2.7.1活菌數及pH結果每隔2 h取樣涂平板測定活菌數及pH，結果如圖5所示。

圖5　高濃度噬菌體條件下活菌數及pHFig.5　The number of fusant and pH under high concentrations of phage

由圖3及圖5可知，Rh6在高濃度噬菌體發酵過程中，生長速度較無噬菌體時有所減慢，菌體量有所減少，但變化不是很大，4～6 h菌體量可達109CFU/mL，達到酸奶發酵標準；而保加利亞乳桿菌L.b與嗜熱鏈球菌S.t的混合發酵劑為噬菌體的敏感菌株，在噬菌體存在的情況下明顯生長緩慢，產酸能力下降，無法滿足酸奶發酵的需要。

2.7.2發酵凝乳時間、滴定酸度、乙醛含量、粘度及感官風味評價結果菌株在高濃度噬菌體存在的條件下的發酵凝乳時間、滴定酸度、乙醛含量、粘度結果見表3，風味感官評價見表4。

表3　高濃度噬菌體條件下的菌株發酵情況（平均值±標準偏差）Table 3　The fermentation results of fusants and susceptible strain under high concentrations of phage（mean±SD）

表4　高濃度噬菌體發酵后酸奶的感官風味評價Table 4　Sensory flavor evaluation of yoghourt under high concentrations of phage

由表3、表4可知，保加利亞乳桿菌L.b與嗜熱鏈球菌S.t的混合發酵劑在高濃度噬菌體條件下發酵的酸奶粘度大幅降低，凝乳時間變長，異常凝乳中檢測發現有雜菌污染；Rh6整體發酵性能較好，粘度有所下降、凝乳時間有所延長，但變化不是很大，高濃度噬菌體的存在對酸奶發酵基本沒有影響。

2.8融合子Rh6的富集培養

對篩選到的融合子Rh6進行富集培養，培養結果如圖6。

圖6　融合子富集培養時的活菌數及pHFig.6　The number of bacteria and pH of fusants enrichment culture

由圖6可知，培養過程中通過緩沖鹽調控pH，融合子的活菌數可達1010CFU/mL，富集培養活菌數達到了制備酸奶發酵劑的要求［18］，可用于工業化生產。

3　結論

通過單親滅活、原生質體融合篩選到一株具有優良酸奶發酵特性及抗噬菌體功能的乳酸菌融合子。經培養條件優化，富集培養時菌體濃度可達1010CFU/mL，適合酸奶發酵工業。

通過對選育到的融合子的發酵特性研究表明：融合子性能優良且可實現酸奶生產單菌株發酵。融合子單獨進行酸奶發酵時，產酸、產粘性物質、產香氣成分等特性均可達到保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌混合發酵的標準；在噬菌體存在的情況下，對噬菌體敏感的混合發酵劑無法完成酸奶發酵，而融合子雖然在菌體生長量方面有所下降（菌體生長量下降原因還不明確），但對酸奶發酵影響不大，完全可以完成酸奶發酵。

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Breedingoffusantbetweensingleinactivated Lactobacillusbulgaricus and bacteriophage-resistant mutant of Streptococcus thermophilus

WANG Mu-hua1，PAN Pei-ping1，ZHAO Yu-ming1，2，SU Bin-nan1，CAI Ying-hui1，LI Hai-tao1，2
（1.Shanxi Institute of Biology，Taiyuan 030006，China；2.Shanxi Veal Biological Dairy Products Co.Ltd.，Taiyuan 030006，China）

To obtain yogurt production strains with functions of phage resistant and good fermentation performance，protoplast fusion between single inactivated Lactobacillus bulgaricus and bacteriophage-resistant mutant of Streptococcus thermophilus was performed by the induction of PEG6000 and the performances of fusant were studied.Finally，three lactic acid bacteria fusants with functions of phage resistant and good fermentation performance were selected from 20 fusants that were obtained through fusion.The fusion rate reached 1.85× 10-6after 2 min of infusion at 40℃in the PEG6000.The performances of the fusant were superior at producing acid，solidifying milk，producing good smell and resisting phage，so it was applicable to yoghurt production.

single inactivation；Lactobacillus bulgaricus；bacteriophage-resistant mutant of Streptococcus thermophilus；protoplast fusion；fusant breeding

TS201.2

A

1002-0306（2015）20-0229-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.040

2015－01－20

王慕華（1975-），女，碩士，副研究員，研究方向：工業微生物、乳品發酵，E-mail：wang_muhua@126.com。

山西省農業科技攻關項目（20120311030）。