產β-葡萄糖苷酶釀酒酵母菌株紫外誘變選育及酶學性質分析

張　莉，王　婧，楊　婷，馬騰臻，程　超，祝　霞，盛文軍，韓舜愈（甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室，甘肅省葡萄酒產業技術研發中心，甘肅蘭州730070）

產β-葡萄糖苷酶釀酒酵母菌株紫外誘變選育及酶學性質分析

張莉，王婧，楊婷，馬騰臻，程超，祝霞，盛文軍，韓舜愈
（甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室，甘肅省葡萄酒產業技術研發中心，甘肅蘭州730070）

為了得到高產胞外β-葡萄糖苷酶的釀酒酵母（Saccharomycaes cerevisiae）菌株，采用紫外線誘變技術對菌株MQFSM-3進行處理，研究了紫外誘變條件對菌株致死率的影響，并對突變菌株酶活及酶學性質進行評價。結果表明，出發菌株在輻照劑量為3500 μJ/cm2的紫外燈下照射9 min，致死率為81.09%；通過初篩、復篩及多次傳代培養，突變菌株UV-45產酶穩定，酶活提高41.64%，該酶最適溫度為50℃，在20～50℃熱穩定性良好；最適pH為5.5，在pH4.0～6.5酶活力相對穩定。

釀酒酵母，紫外誘變，篩選，突變體

葡萄漿果中存在游離態和結合態兩大類呈香物質，游離態呈香物質可以直接從葡萄酒中揮發出來，是典型葡萄酒風味的主要來源。結合態呈香物質是不具揮發性、沒有芳香氣味的糖苷鍵合態風味前體物質，其含量比游離態的要豐富得多［1］，如果得以釋放，對葡萄酒品種風味的呈現具有積極意義。β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，BGL，EC 3.2.1.21）是結合態香氣釋放的關鍵酶，它可催化水解葡萄糖苷鍵，同時釋放出糖苷配基，能夠改善和增強葡萄酒的香氣［2］。該酶廣泛存在于植物和微生物中，然而，外加酶及果實內源的β-葡萄糖苷酶在典型葡萄酒的低pH、高酒精度、葡萄糖存在和低氧環境中活性很低或受到抑制［3］。微生物來源的β-葡萄糖苷酶受抑制的程度與菌株的種類和特性有關［4］，有研究報道表明，利用釀酒酵母（Saccharomycaes cerevisiae）產生的β-葡萄糖苷酶是提高葡萄酒香氣的有效方法［5］。但在發酵中，釀酒酵母釋放的β-葡萄糖苷酶活性較低。因此提高酵母菌株產β-葡萄糖苷酶活力是提高葡萄酒香氣的重要研究方向之一。

誘變育種是用人工誘變的方法誘發微生物基因突變，通過隨機篩選，篩選出產量高、性能優良的突變體。其中紫外輻照作為物理誘變因子應用于工業微生物菌種的誘變選育具有悠久的歷史，紫外輻照設備簡單，操作簡便，效果明顯，是微生物菌種誘變選育的首選誘變因子［6］。

據文獻報道，酵母菌株對紫外輻照處理敏感性較強，張陳云等［7］利用紫外誘變技術得到了一株發酵性能較好的釀酒酵母菌株。李楊等［8］利用紫外線與亞硝基胍復合誘變技術處理釀酒酵母原生質體，得到一株高產酒精的突變菌株。Ruchi等［9］利用化學與物理復合誘變技術處理枯草芽孢桿菌，使其產β-葡萄糖苷酶活性提高1.2倍。但是，系統研究紫外線輻照誘變技術在提高酵母產β-葡萄糖苷酶的應用報道較少。

本研究以實驗室保存的野生釀酒酵母菌株為出發菌，通過紫外誘變處理，分析其產生β-葡萄糖苷酶的條件參數及酶學特性，旨在選育出高產β-葡萄糖苷酶的突變菌株，為葡萄酒釀造提供優良的生產菌株。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

釀酒酵母菌株（Saccharomycescerevisiae）MQFSM-3由甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室分離保存［10］；對硝基苯-β-D-葡萄糖苷（p-NPG）

Sigma公司；對硝基苯酚（p-NP） 天津市凱信化學工業有限公司；酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂等均為國產分析純。

CL-1000紫外交聯機美國UVP公司；湘儀高速冷凍離心機長沙湘儀離心機儀器有限公司；紫外-可見分光光度計Thermo Fisher scientific公司；SWCJ-2FD型超凈工作臺蘇州安泰空氣技術有限公司；SYQ-DSX-280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器上海申安醫療器械廠。

1.2實驗方法

1.2.1培養基配制YPD液體培養基：酵母浸膏1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%，自然pH，121℃滅菌20 min；YEPD固體培養基：酵母浸膏1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%，瓊脂2.0%，自然pH，121℃滅菌20 min，溫度降至70℃左右，加入60 μg/mL鏈霉素；發酵培養基［11］：酵母浸膏1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%，NH4NO30.3%，KH2PO40.4%；初篩培養基［10］：馬鈴薯20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，自然pH，121℃滅菌20 min，在溫度降到60～70℃左右加入1 g/L p-NPG。

1.2.2原菌株活化培養將出發菌株MQFSM-3接種一環于YEPD斜面培養基上，28℃培養24 h后，接入50 mL YPD液體培養基中28℃，160 r/min擴增培養48 h。將活化好的酵母菌按5%的接種量轉入20 mL YPD液體培養基中，28℃，160 r/min振蕩擴增培養48 h。

1.2.3生長曲線繪制取17個50 mL三角瓶，分別裝入20 mL YPD液體培養基滅菌備用。將菌株MQFSM-3擴增培養液按5%接種量分別接入，并于28℃，160 r/min培養，每隔4 h取樣。以不接菌的YPD液體培養基為空白對照，在OD600下測吸光度值，繪制菌株生長曲線［12］。

1.2.4菌株紫外線誘變及篩選取對數生長期的培養液，8000 r/min離心10 min收集酵母菌體，并以適量無菌生理鹽水洗滌2次。將酵母菌體懸浮于無菌生理鹽水中，并以無菌生理鹽水進行10倍系列逐級稀釋，然后配成105～108cfu/mL的菌懸液。

1.2.4.1不同紫外照射劑量處理將菌懸液置于無菌培養皿中，放置在紫外交聯機中，于不同照射劑量（1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000 μJ/cm2）下照射7 min，取樣5 mL，冰浴30 min并暗處放置4 h，之后梯度稀釋取10-4、10-5、10-6稀釋度菌懸液涂布于YPD固體培養基上，30℃避光培養48 h，以上所有操作須在紅光下進行［13］，以沒有做誘變處理的涂布平板作為對照，計算菌落數及紫外誘變致死率［9］。

致死率計算公式如下：

1.2.4.2不同紫外照射時間處理將菌懸液置于無菌培養皿中，放置在紫外誘變箱中，于3500 μJ/cm2的照射劑量下分別照射1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23 min后，取樣5 mL，其他操作同1.2.4.1，計算菌落數及紫外誘變致死率。

1.2.4.3突變菌株篩選初篩：將最佳誘變條件下的單菌落，挑入以p-NPG為底物的96孔板初篩培養基上，28℃培養3 d后，噴灑1 mol/L Na2CO3，觀察顯色情況，并挑選明顯呈黃色的菌落作為高產菌株進行復篩［2］。復篩：將初篩顯色明顯的突變菌株接種至發酵培養基中28℃培養72 h，將發酵液于8000 r/min離心10 min后，收集上清液，即粗酶液，用于測定酶活力，篩選出酶活較高的菌株。

1.2.5酶活測定

1.2.5.1標準曲線繪制稱取對硝基苯酚139.0 mg，蒸餾水定容至1000 mL，分別吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于100 mL容量瓶中，用1 mol/L Na2CO3溶液定容后混勻。以蒸餾水作為空白，于400 nm處測其吸光值。以對硝基苯酚濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線［11］。

1.2.5.2酶活測定取0.1 mL粗酶液，加入0.2 mL 40 mmol/L p-NPG（pH5.5的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液配制）混勻，50℃保溫10 min后立即加入2 mL 1 mol/L Na2CO3終止反應并顯色，室溫放置5 min，于400 nm下測定吸光值。以加熱滅活的酶液按照同樣處理做空白對照［14-15］。

酶活力計算公式如下：

式中：U為酶活力單位，U/mL；C為對硝基苯酚（p-NP）的濃度；V為反應體系的體積；N為原酶液稀釋倍數；t為反應時間；0.1為所取上清液或細胞液的體積。

β-葡萄糖苷酶酶活力力單位（U）定義為，在上述反應條件下，1 min內底物被釋放出1 μmol的p-NP所需要的酶量［15］。

1.2.6突變菌株產酶穩定性驗證對復篩獲得的高產β-葡萄糖苷酶突變菌株進行傳代培養，連續傳代10次，測其β-葡萄糖苷酶酶活，觀察產酶穩定性［9］。

1.2.7突變菌株生長曲線將篩選的產酶穩定的突變菌株活化后接種至YPD培養基中，于28℃、160 r/min培養，每隔4 h取樣，在OD600下測吸光度值，繪制突變菌株生長曲線。

1.2.8突變菌株β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶學性質

1.2.8.1β-葡萄糖苷酶最適溫度將粗酶液0.1 mL與0.2 mL pH5.5的p-NPG混合，分別在20、30、40、50、60、70、80℃環境下反應10 min，并測定酶活力［16］。

1.2.8.2β-葡萄糖苷酶的熱穩定性將粗酶液分別置于20、30、40、50、60、70、80℃恒溫水浴鍋中保溫60 min，冷卻后測定酶活，計算相對酶活力（以4℃保存的原酶液酶活力為100%）［17］，評價β-葡萄糖苷酶的熱穩定性。

1.2.8.3β-葡萄糖苷酶最適pH將粗酶液0.1 mL分別與0.2 mL pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的p-NPG混和，在50℃下反應10 min［16］，測定各組酶活力。

1.2.8.4β-葡萄糖苷酶的pH穩定性在0.8 mL pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸緩沖液中，分別加入0.2 mL的粗酶液，4℃保溫24 h，分別測定剩余酶活力，計算相對酶活力（以加入0.8 mL雙蒸水的酶活力為100%）［17］，評價β-葡萄糖苷酶的pH穩定性。

1.3數據統計分析

所有平均值數據經過IBM SPSS statistics 18.0軟件進行分析，數據以結果±標準差SD表示。

2　結果與分析

2.1對硝基苯酚溶液標準曲線

對硝基苯酚在堿性條件下顯黃色，在一定范圍內，其濃度與吸光值成正比。如圖1所示，對硝基苯酚標準曲線回歸方程為：Y=19.957x－0.0087，相關系數R2=0.9970，吸光度與對硝基苯酚含量成線性關系。

圖1　對硝基苯酚溶液標準曲線Fig.1　Standard curve of p-nitrophenol solution

2.2釀酒酵母MQFSM-3生長曲線

酵母MQFSM-3的生長曲線如圖2。由圖2可知，4～24 h為對數生長期，4 h以后酵母進入對數生長期說明該野生釀酒酵母繁殖迅速。28 h后為穩定期，菌體濃度基本保持不變。由于對數生長期的細胞為生理活性一致的活細胞，突變率高，重現性好［12］，因此本實驗選擇對數生長中期的菌體進行誘變，即選擇培養16 h的菌體進行誘變處理。

圖2　酵母MQFSM-3生長曲線Fig.2　Growth curves of yeast MQFSC-3

2.3釀酒酵母MQFSM-3紫外誘變

2.3.1不同照射劑量下酵母致死率曲線出發菌株MQFSM-3在不同紫外劑量照射下與致死率的關系如圖3所示，MQFSM-3菌株細胞對紫外光非常敏感。隨著照射劑量增大，菌株致死率呈上升趨勢。據文獻報道，紫外誘變的致死率在75%～85%之間時，突變率相對較高［18］，獲得優良性能菌株的可能性更大［19］。因此選擇80%左右的致死率，即誘變劑量為3500 μJ/cm2。

圖3　紫外輻照劑量對酵母致死率的影響Fig.3　Effect of radiation dose on lethality of yeast

2.3.2不同照射時間下酵母致死率曲線據文獻報道，紫外誘變照射時間不短于10～20 s，不長于10～20 min［20］。紫外輻照時間與致死率的關系如圖4所示，MQFSM-3隨著照射時間增長，菌株致死率呈上升趨勢，在照射9 min時致死率達到了81.09%。

2.4突變菌株篩選

由于p-NPG經β-葡萄糖苷酶水解后的產物p-NP在堿性條件下顯黃色［21］，因此將其作為反應底物，利用96孔板培養進行菌株初篩，根據顏色深淺來初步判斷酶活高低，顏色越深則酶活越高，以此篩選出顏色較深的12株菌株UV-11、UV-12、UV-22、UV-23、UV-24、UV-34、UV-35、UV-36、UV-44、UV-45、UV-46、UV-59。

圖4　紫外輻照時間對酵母致死率的影響Fig.4　Effect of radiation time on lethality of yeast

圖5　突變體β-葡萄糖苷酶酶活Fig.5　β-glucosidase activity of Mutant

通過對這12株菌搖瓶發酵復篩，所得結果見圖5。對12株菌復篩所得的酶活力數據進行方差分析，根據顯著性分析，UV-11、UV-12、UV-23、UV-34、UV-45，這5株突變體與出發菌株MQFS M-3酶活力差異顯著（p＜0.05），分別比出發菌株提高了70.85%、57.54%、69.23%、56.47%、65.82%，說明菌株UV-11、UV-12、UV-23、UV-34、UV-45菌株所產β-葡萄糖苷酶活力比原菌株有明顯提高。因此選擇這五株突變體進行進一步實驗。

2.5突變菌株產酶穩定性研究

將復篩得到的突變菌株UV-11、UV-12、UV-23、UV-34、UV-45經過多次傳代后測酶活，結果如圖6所示，只有菌株UV-45傳代10次后β-葡萄糖苷酶酶活仍保持了85.14%，且傳代后比出發菌株MQFSM-3的酶活力提高了41.64%。因此選擇UV-45為目標菌株做進一步研究。

2.6MQFSM-3與突變體UV-45生長曲線

圖6　突變體產酶穩定性Fig.6　Stability of Mutant enzyme production

圖7MQFSM-3與UV-45生長曲線Fig.7　Growth curves of MQFSM-3 and UV-45

突變菌株與出發菌株MQFSM-3生長曲線比較見圖7。由圖7可知，突變菌株UV-45生長曲線與出發菌株MQFSM-3基本一致，4～20 h為對數生長期，20 h后進入穩定期，菌體濃度基本保持不變，比出發菌株提前4 h進入穩定期。

2.7突變菌株U-45粗酶液的部分酶學性質分析

2.7.1β-葡萄糖苷酶的最適溫度由圖8可知，β-葡萄糖苷酶的最適溫度約為50℃。溫度低于50℃時，酶活力隨溫度的升高而增大；溫度高于50℃時，酶活力隨溫度的升高而降低。溫度為80℃時酶幾乎失活。

圖8　β-葡萄糖苷酶最適溫度Fig.8　Optimal reaction temperatury of β-glucosidase

2.7.2β-葡萄糖苷酶熱穩定性菌株UV-45 β-葡萄糖苷酶熱穩定性實驗結果如圖9所示，溫度在50℃以下時酶的穩定性相對較好，能夠保持80%以上的酶活力，當溫度超過50℃，酶活力急劇下降。當溫度高于60℃時，基本不具備酶活。

2.7.3β-葡萄糖苷酶最適pH由圖10可知，β-葡萄糖苷酶的最適pH為5.5，酶活為75.34 U/mL。當pH低于5.5時，酶活力隨著pH增高而增加；pH3.0環境下，β-葡萄糖苷酶活力為25.93 U/mL，是pH5.5時酶活的34.42%；當pH高于5.5時，酶活力開始下降；pH8.0環境下酶活力為29.01 U/mL。

2.7.4β-葡萄糖苷酶pH穩定性實驗結果如圖11所示，β-葡萄糖苷酶在pH4.0～6.5酶活力相對穩定，均在80%以上。當pH低于4時，相對酶活在60%以下；當pH大于6.5時，酶活力急劇下降，并在pH7.5環境下，相對酶活僅為30%。

圖9　β-葡萄糖苷酶的熱穩定性Fig.9　Thermal stability of β-glucosidase

圖10　β-葡萄糖苷酶最適pHFig.10　Optimal pH of β-glucosidase

圖11　β-葡萄糖苷酶的pH穩定性Fig.11　pH stability of β-glucosidase

3　結論

本文以本實驗室保存的一株釀酒酵母MQFSM-3為出發菌株，以紫外照射其對數生長期菌體的方法進行誘變，經顯色反應初篩和比色法復篩，得到了突變體UV-11、UV-12、UV-23、UV-34、UV-45，這5株突變體的β-葡萄糖苷酶的酶活較出發菌株有明顯提高，并根據產酶穩定性確定UV-45為最優突變體。

動態跟蹤了UV-45的生長規律，并研究其粗酶液的酶學性質，研究表明，該酶在20～50℃均具有較高的催化活力，其最適反應溫度為50℃；β-葡萄糖苷酶在pH為4.0～6.5之間具有較高的酶活力，并且在pH為5.5時酶活力最高，即最適催化pH為5.5。

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UV mutation of production Saccharomyces cerevisiae strain of β-glucosidase and its enzyme characteristics

ZHANG Li，WANG Jing，YANG Ting，MA Teng-zhen，CHENG Chao，ZHU Xia，SHENG Wen-jun，HAN Shun-yu
（College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Gansu Key Lab of Viticulture and Enology，Research and Development Center of Wine Industry Technology in Gansu Province，Lanzhou 730070，China）

In order to screen a high extracellular β-glucosidase producing mutant strain of Saccharomycaes cerevisiae，the method of UV mutation was used on wild yeast of MQFSM-3.Death rate affected by UV mutagenesis conditions were determined，enzyme activity and enzymatic characteristics of mutant strain were also evaluated.The results showed that the dose of 3500 μJ/cm2，irradiation 9 min，mortality reached 81.09%. By preliminary screening，rescreening and subculturing for many times，a stable enzyme production of mutant UV-45 was obtained.Compared with the original strain，its enzyme activity was improved 41.64%.The enzymatic characteristics were analyzed that the optimum temperature of UV-45 was 50℃，and it had a good thermal stability between 20～50℃.The optimum pH was 5.5，and between pH4.0 to 6.5，the enzyme activity was relatively stable.

Saccharomycaes cerevisiae；UV mutagenesis；select；mutant

TS201.1

A

1002-0306（2015）20-0220-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.038

2015－03－16

張莉（1987-），女，碩士，研究方向：釀酒微生物，E-mail：15117115362@163.com。

韓舜愈（1963-），男，博士，教授，研究方向：果蔬加工及葡萄酒釀造，E-mail：gsndhsy@163.com。

國家自然科學基金資助項目（31160310）；甘肅省農業生物技術專項（GNSW-2013-16）；甘肅省青年科學基金（1208RJYA082）。