響應面法優化黃鯽蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德反應的條件

阮關強，沈燕，韋榮編，宋茹

(浙江海洋學院食品與醫藥學院，浙江舟山316022)

抗菌肽(Antibacterial peptide)通常又被稱為抗微生物肽或肽抗生素，是一種廣泛存在于自然界中的具有抗菌、抗病毒，甚至抗腫瘤活性的多肽類。自第1個抗菌肽從惜古比天蠶蛹中被分離以來，研究者陸續從動植物中分離、純化到不同種類的抗菌肽［1-2］。采用酶解法制備的黃鯽蛋白抗菌液(HAHp)不僅具有較強的抑菌性，而且還具有抗腫瘤和抗氧化生物活性［3-7］。但是，HAHp有一定的魚腥味和苦味，對其今后廣泛應用不利。前期研究發現美拉德修飾反應不僅能夠提高黃鯽蛋白抗菌液的抑菌性，而且能夠有效改善該抗菌液的風味性。筆者采用響應面分析法對黃鯽蛋白抗菌液和葡萄糖的美拉德反應條件進行優化處以期獲得對水產品常見致病菌副溶血弧菌具有強抑菌作用的黃鯽蛋白抗菌液美拉德反應物，從而為黃鯽蛋白抗菌液在水產品中應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 黃鯽。黃鯽購于舟山水產市場。

1.1.2 指示菌。副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)，為浙江海洋學院食品與醫藥學院實驗室保存菌種。

1.1.3 主要儀器及試劑。

1.1.3.1 主要儀器。恒溫恒濕培養箱(上海慧泰儀器制造有限公司);臺式PHS-3C精密pH計(上海虹益儀器儀表有限公司);立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業有限公司醫療設備廠);雙列四孔恒溫水浴鍋(上海慧泰儀器制造有限公司)。

1.1.3.2 主要試劑。營養瓊脂，購于杭州天和微生物試劑有限公司;胃蛋白酶，購于中國醫藥集團上海化學試劑公司;其他試劑均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 抑菌圈法。將副溶血性弧菌用肉湯液體培養基活化至對數生長期，取100 μl副溶血弧菌菌懸液加入滅菌培養皿中，然后加入45～50℃左右的營養瓊脂培養基15 ml，混勻，待營養瓊脂凝固后，用滅菌打孔器(內徑8 mm)打孔，然后每孔加入經0.45 μm濾膜過濾除菌的樣品液25 μl。將培養皿放置37℃培養箱中培養12 h，觀察抑菌圈是否形成，并測量抑菌圈直徑。每個樣品平行測定2次，抑菌圈大小用平均值表示。

1.2.2 響應面法優化。在前期單因素試驗的基礎上，選擇葡萄糖添加量、反應初始pH、加熱時間和加熱溫度進行優化進行4因素3水平的Box-Behnken響應面分析試驗(因素和水平設計見表1，試驗方案設計見表2)，采用最小二乘方法對試驗數據進行多項式回歸分析，得到以下二次方方程:

其中y為響應值;α0為常數項;αj、αjj和 αij分別為一次項、平方和交互作用的回歸系數;βi和βj為變量水平。采用Design Expert Software軟件對試驗數據進行統計分析，優化最佳的美拉德反應條件，然后在優化條件下進行驗證試驗，以判斷優化反應條件是否合理。

2 結果與分析

2.1 Box-Behnken響應面分析試驗結果 Box-Behnken響應面分析試驗結果見表2。將表2中數據進行二次回歸方程擬合，得到響應值與各因素間的二次回歸方程為:Y=23.02+0.52X1+1.04X2+0.53X3-0.21X4+0.18X1X2+0.40X1X3-0.20X1X4-0.48X2X3+0.42X2X4+0.05X3X4+0.37X12+0.82X22+1.07X32+1.05X42。

表1 Box-Behnken響應面分析試驗因素及水平

表2 Box-Behnken響應面分析試驗設計及結果

方差分析結果表明，模型P值小于0.000 1，說明模型極顯著;失擬項的P值大于0.05，說明失擬項不顯著，且模型的相關系數R2為0.902 2，表示該模型條件能夠很好地反映實際值。當P值小于0.05時，因素對響應值影響顯著。由此可見，葡萄糖添加量、反應初始pH和加熱時間對黃鯽蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德產物的抑菌活性線性影響顯著。雖然各因素間的交互作用對美拉德產物的抑菌活性影響不顯著，但是通過因素間交互作用分析有助于揭示各因素間變化對美拉德產物抑菌活性的影響。因此，筆者進一步分析了因素間的交互作用對美拉德產物的抑菌活性的影響趨勢。

從圖1可以看出，在一定葡萄糖添加量下，反應初始pH的加大有利于黃鯽蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德反應物的抑菌性增強，而當反應初始pH一定時，黃鯽蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德反應物的抑菌圈直徑隨著葡萄糖添加量的加大而增加，說明葡萄糖添加量和反應初始pH對產物抑菌活性的增加有線性影響。從圖2可以看出，當葡萄糖添加量一定時，美拉德反應產物的抑菌性先隨著加熱時間的增加而減少，此后隨著加熱時間的延長而逐漸地增強。從圖3可以看出，無論在葡萄糖高添加量(如3%)還是低添加量(如0.8%)時，黃鯽蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德產物的抑菌活性均隨著加熱溫度的升高先減小后增加，說明加熱時間和加熱溫度對鯽蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德產物的抑菌性影響在特定加熱時間和加熱溫度范圍內具有一定線性影響。圖4～6中各因素間交互作用也出現類似情況。黃鯽蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德產物的抑菌性在兩因素交互區間會出現最低值，說明黃鯽蛋白抗菌液與葡萄糖發生美拉德反應過程中，在特定條件下不利于產物抑菌活性的增加，可能與黃鯽蛋白抗菌液中抑菌活性物質發生改變或轉化有關，因此在反應過程中要避開這些反應條件，如葡萄糖添加量1.0%、反應初始pH6.5、加熱時間50 min和加熱溫度100℃等。

2.2 驗證試驗 采用Design Expert Software軟件對得到的擬合方程進行分析，最終確定黃鯽蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德反應的最佳條件為:葡萄糖添加量3%，反應初始pH為9.0，加熱時間為100 min，加熱溫度為120℃。在此條件下得到的美拉德產物對指示菌副溶血弧菌的抑菌圈直徑理論值達到28.6 mm，在優化反應條件下進行了3組平行試驗，得到的美拉德反應產物對副溶血弧菌的抑菌圈平均直徑為28.1 mm，與理論值非常接近，表明試驗確定的優化條件是合理的。

3 小結

響應面分析試驗有效優化了黃鯽蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德反應條件，以美拉德產物對副溶血弧菌的抑菌性為響應值，確定最佳美拉德反應條件為:葡萄糖添加量3%，反應初始pH為9.0，加熱時間為100 min，加熱溫度為120℃。

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