一株產(chǎn)堿性磷酸酶菌株的鑒定及酶的純化

舒彥芳，馬小花，杜詩(shī)熠，任 敏

(1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300;2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300)

堿性磷酸酶(Akaline phosphatases，AP，EC 3.1.3.1)是在堿性條件下將有機(jī)磷化合物釋放為無(wú)機(jī)磷的一種低特異性的磷酸單脂酶。該酶在酶聯(lián)免疫測(cè)定、生物傳感器、雜交和測(cè)序、分子遺傳學(xué)、農(nóng)業(yè)生活中起非常重要的作用。從微生物到真核生物都可以找到該酶的蹤跡，尤其是一些生活磷限制環(huán)境的微生物細(xì)胞，其堿性磷酸酶在碳、氮代謝中起非常重要的作用［1-2］。

從1960年開(kāi)始，各種來(lái)源的堿性磷酸酶被陸續(xù)報(bào)道。大腸桿菌的堿性磷酸酶的結(jié)構(gòu)、功能及催化特性是研究得最為清楚的。許多哺乳動(dòng)物的堿性磷酸酶已被研究。研究者從深海的火山口附近分離出一種產(chǎn)堿性磷酸酶的古熱球菌。該菌的堿性磷酸酶能耐100℃高溫。自極端環(huán)境獲得的微生物所產(chǎn)生的酶及基因產(chǎn)物由于能夠在特定的苛刻條件下保持穩(wěn)定并發(fā)揮較大的酶活，已引起研究者們極大的興趣［3-5］。筆者就從實(shí)驗(yàn)室保存的極端嗜鹽古菌進(jìn)行堿性磷酸酶初步篩選，并對(duì)酶活高的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、基因型等進(jìn)行鑒定，為工業(yè)用酶的開(kāi)發(fā)以及極端來(lái)源堿性磷酸酶嗜極機(jī)制的后續(xù)研究提供材料和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及培養(yǎng)基。極端嗜鹽古菌tarim4為實(shí)驗(yàn)室分離自硝爾庫(kù)勒鹽湖(40°41＇N，76°53＇E)。培養(yǎng)基中含酸水解酪蛋白7.5 g/L，酶母提取物10 g/L，檸檬酸三鈉3 g/L，MgSO4·7H2O 20 g/L，KCl 2 g/L，F(xiàn)eCl2·4H2O 0.036 9 g/L，NaCl 200 g/L，pH 7.2。蒸餾水900 ml，高溫滅菌。標(biāo)準(zhǔn)菌株Natrinema pellirubrum CGMCC 1.3708T購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物所。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備。試劑有1×TE溶液、溶菌酶(50 mg/ml)、DNA聚合酶(廣州東盛)、pMD18-T載體(大連TaKaRa)、DNA 回收純化試劑盒(上海生工);IPTG、X-gal、濃度20%NaCl溶液、磷酸苯二鈉、Q瓊脂糖凝膠FF/Q Sep、Superdex 20050mM Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液，瓊脂糖凝膠柱(10 mm ×300 mm)。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)特征。細(xì)胞形態(tài)、運(yùn)動(dòng)性按照文獻(xiàn)［6］進(jìn)行。

1.2.2 生理生化生長(zhǎng)條件及抗生素敏感。按照文獻(xiàn)［6］檢測(cè)以下指標(biāo):菌體細(xì)胞生長(zhǎng)所需鹽濃度范圍及最適NaCl、MgCl2、pH、溫度等;硝酸鹽、精氨酸和二甲基亞砜的厭氧實(shí)驗(yàn)，硝酸鹽、亞硝酸鹽還原硝酸鹽產(chǎn)氣，H2S產(chǎn)氣，碳氮利用及抗生素敏感。主要用的抗生素有紅霉素、氯霉素、利福平、桿菌肽、青霉素、新霉素、氨芐青霉素、環(huán)丙沙星、新生霉素、氟哌酸、鏈霉素、萬(wàn)古霉素、卡那霉素、呋喃妥因、甲氧芐啶。

1.2.3 基本碳源和能源物質(zhì)生長(zhǎng)利用。按照文獻(xiàn)［7］進(jìn)行基本碳源和能源生長(zhǎng)利用試驗(yàn)。所選擇的42種碳、氮源為:葡萄糖、半乳糖、棉籽糖、甘露糖、果糖、L-山梨糖、D-木糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、甘油、甘露醇、D-山梨醇、醋酸鹽、丙酮酸鹽、DL-乳酸鹽、琥珀酸鹽、延胡索酸鹽、L-蘋(píng)果酸鹽、檸檬酸鹽、L-結(jié)氨酸、甘氨酸 L-丙氨酸、L-蘇氨酸、L-酪氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-鳥(niǎo)氨酸、L-脯氨酸、L-天冬酰胺、L-蛋氨酸、L-色氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-絲氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酸鹽、L-苯丙氨酸、L-異亮氨酸。

1.2.4 16S rRNA基因序列分析。

1.2.4.1 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增。按照文獻(xiàn)［6］進(jìn)行菌體總DNA的提取。古菌16S rRNA基因通用引物F1:5＇-TTCCGGTTGATCCTGCC-3＇ 和 R1:5＇-AAGGAGGTGATCCAGCC-3＇，擴(kuò)增片段大小約1.5 kb。PCR反應(yīng)體系:10×Taq緩沖液 2.5 μl，dNTP 混 合 物 (2.5 mmol/L)3 μl，F(xiàn)1(10 μmol/L)0.5 μl，R1(10 μmol/L)0.5 μl，Taq 酶(5 U/μl)0.3 μl，模板 DNA 0.5 μl，ddH2O 補(bǔ)至 25 μl。PCR 反應(yīng)條件為:95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，51 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30 個(gè)循環(huán)，72℃10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠1%(W/V)電泳，染色后在凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照(目的條帶大小為1.5 kb)。

1.2.4.2 克隆測(cè)序。將目的大小的PCR產(chǎn)物回收、純化后與pMD18-T載體相連，重組片段經(jīng)過(guò)DH5α大腸桿菌克隆增殖后，用上述古菌通用引物菌落PCR驗(yàn)證，選取陽(yáng)性克隆20個(gè)，送由上海生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.4.3 16S rRNA基因分析。用DNAStar軟件包中Seq-Man軟件剪輯所得序列，剪輯后序列通過(guò)Eztaxon server 2.1分析其潛在的分類(lèi)地位，并且采用MEGA5.0軟件包中的Clustal W對(duì)下載相關(guān)序列多位序列比較，對(duì)比較后的序列采用N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5 DNA的G+C mol%含量測(cè)定。G+C mol%含量測(cè)定采用熱變性溫度法(Tm值法)［7］。

1.3 酶活檢測(cè)及酶純化

1.3.1 堿性磷酸酶活性檢測(cè)［8］。將新鮮菌懸液離心，用液氮和常溫反復(fù)凍融，12 000 r/min，4℃ 離心10 min，取上清液500 μl加到1 000 μl含4-氨基安替比林(0.15%，W/V)的碳酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 10)，37℃水浴5 min，再加入磷酸苯二鈉(0.02 mol/L)1 000 μl，37℃水浴15 min后立刻加入3 μl鐵氰化鉀溶液，立即充分混勻后，將其在分光光度計(jì)510 nm波長(zhǎng)處比色，用蒸餾水調(diào)零，以未接種的培養(yǎng)液為對(duì)照。酶活定義為37℃下每分鐘產(chǎn)生1 μmol游離酚的酶量為一個(gè)酶活單位(U)。

1.3.2 微孔板法初篩堿性磷酸酶產(chǎn)生菌。將0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液(4-氨基安替比林，pH 10.0)50 μl點(diǎn)樣于40孔微孔板中(對(duì)照孔加量為55 μl)，用無(wú)菌牙簽取各菌種等量菌苔與上述緩沖液充分混勻，37℃水浴5 min放置后，將已預(yù)熱的磷酸苯二鈉溶液(0.02 mol/L)50 μl加入孔中，37℃反應(yīng)15 min后加入鐵氰化鉀溶液150 μl，顯色，并終止反應(yīng)。以紅色作為初篩產(chǎn)堿性磷酸磷酸酶的菌體。

1.3.3 酶的純化及SDS-PAGE檢測(cè)［9］。

1.3.3.1 制備粗酶液。新鮮菌液按1%接入2 L CM(濃度20%NaCl，pH 8.0)液體培養(yǎng)基中，放入 37℃ 搖床，200 r/min培養(yǎng)72 h左右。當(dāng)OD600nm在1.0以上時(shí)，10 000×g離心10 min，4℃，收集菌體。菌體用50 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)重懸，超聲裂解。10 000×g離心20 min，4℃ 離心，上清即為粗酶液體。粗酶液體-80℃ 保存。

1.3.3.2 (NH4)2SO4沉淀。將上述粗酶液體加入硫酸銨至80% 飽和度，4℃ 靜置過(guò)夜。10 000×g離心15 min，將沉淀溶解Tris-HCl(50 mmol/L，pH 8.0)緩沖液，將酶液脫鹽冷凍干燥后-40°保存。

1.3.3.3 初步純化酶蛋白。將上述脫鹽的酶液用平衡液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)溶解，加到用50 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0充分平衡后的Q瓊脂糖凝膠FF柱，用0.1～2.0 mol/L NaCl(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)洗脫液洗脫，收集0.4 ～0.8 mol/L NaCl(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)，各個(gè)組分放于-80℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)學(xué)特征 細(xì)胞呈球形(圖1)，大小2.73 μm，無(wú)鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。革蘭氏陰性菌，在牛奶鹽平板上培養(yǎng)至7 d時(shí)菌落呈圓形，橘色，表面光滑濕潤(rùn)，有黏性，邊緣較整齊，菌落直徑為1～2 mm。

2.2 生理生化及生長(zhǎng)條件、抗生素敏感試驗(yàn)

2.2.1 生理生化及生長(zhǎng)條件。

2.2.1.1 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。tarim4在溫度37～40℃時(shí)都能生長(zhǎng)，但是37℃是最適的生長(zhǎng)溫度。

2.2.1.2 NaCl質(zhì)量濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。tarim4在NaCl質(zhì)量濃度為8% ～20% 的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，最適生長(zhǎng)為15%;NaCl濃度12% ～23%是tarim4和Natrinema pellirubrum CGMCC 1.3708T生長(zhǎng)較適合的范圍。

2.2.1.3 Mg2+質(zhì)量濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。tarim4不需要Mg2+就能進(jìn)行生長(zhǎng)。相比較來(lái)說(shuō)，Mg2+濃度0.005～0.3 mol/L是菌株Natrinema pellirubrum CGMCC 1.3708T較適合生長(zhǎng)的范圍。

2.2.1.4 pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。tarim4生長(zhǎng)所需pH為4.0～11.0，最適pH 8.5，而參照菌株Natrinema pellirubrum CGMCC 1.3708T生長(zhǎng)所需的pH 6.0～8.0都可以生長(zhǎng)。

2.2.1.5 抗生素敏感試驗(yàn)。菌株tarim4對(duì)桿菌肽、新生霉素敏感，對(duì)紅霉素、新霉素、利福平、氯霉素、氨芐青霉素、諾氟沙星、鏈霉素、卡那霉素、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素、制霉菌素、呋喃妥因、萘啶酸等不敏感。

2.2.2 碳、氮源利用。菌株tarim 4能利用果糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉、甘油、甘露醇、D-山梨醇、醋酸鹽、DL-乳酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、L-鳥(niǎo)氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酸鹽等作為唯一碳源、能源生長(zhǎng)，不能利用甘露糖、半乳糖、L-山梨糖、D-木糖、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-絲氨酸、L-亮氨酸等;而相近菌株Natrinema pellirubrumCGMCC1.3708T能利用葡萄糖、半乳糖、L-山梨糖、D-木糖、DL-乳酸鹽、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-鳥(niǎo)氨酸、L-絲氨酸等，不能利用甘露糖、果糖、D-核糖、阿拉伯糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、甘油、甘露醇、D-山梨醇、醋酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、L-賴氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酸鹽。它們?cè)谔荚础⒌吹睦蒙洗嬖诓町悺?/p>

2.3 基因型特征

2.3.1 16S rRNA基因。

2.3.1.1 16S rRNA基因擴(kuò)增。采用古菌通用引物，對(duì)tarim4所提取的基因組DNA進(jìn)行16S rRNA基因序列擴(kuò)增且測(cè)序，得到幾乎全長(zhǎng)的16S rRNA基因序列，經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)，條帶大小約為1.5 kb(圖2)。序列提交NCBI，并獲得登錄號(hào)(JX44467)。

2.3.1.2 16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析。將tarim4的16S rRNA基因克隆測(cè)序結(jié)果上傳至GenBank(登錄號(hào)為JX44467)，序列大小為1 474 bp。將序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，再用MEGA5.0的Neighbor-jioning構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。從圖3可以看出，與該菌株嗜鹽古菌鈉線菌Natrinema屬處于個(gè)分支。16S rRNA測(cè)序結(jié)果與有效發(fā)表的參比菌株鈉線菌屬Natrinema pallidum相似度為97%，為一個(gè)潛在新物種。

2.3.2 DNA的G+C mol% 含量測(cè)定。菌株tarim 4的基因組DNA中G+C含量為63.1%，相近菌株Natrinema pallidumG+C含量為63.1%，Natrinema altunense的G+C含量為63.1%。它們均屬于高G+C的革蘭氏陰性菌。

2.4 酶的純化檢測(cè)

2.4.1 微孔板法初篩堿性磷酸酶產(chǎn)生菌。采用磷酸苯二鈉比色法，從實(shí)驗(yàn)室保存的86株極端嗜鹽古菌篩選出具有堿性磷酸酶活性的菌株為8株(部分菌株)。經(jīng)酶活測(cè)定，確定酶活力最高且較穩(wěn)定的菌株為tarim4，故選該菌株進(jìn)一步研究。

2.4.2 堿性磷酸酶的分離、純化。經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、純化后的蛋白的SDS-PAGE電泳圖出現(xiàn)單一條帶，分子量約為45 kDa(圖4)。

3 討論

嗜鹽微生物生長(zhǎng)于高鹽環(huán)境，根據(jù)其鹽濃度不同可分為低度嗜鹽、中度嗜鹽、高度嗜鹽。一般，鹽濃度5% ～20%的為中度嗜鹽微生物，大于20%的為極端嗜鹽微生物。大量研究表明，嗜鹽蛋白存在大量的酸性氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸，大量的鈉離子存在更有利于其肽鏈的折疊且維持其活性［9］。堿性磷酸酶來(lái)源非常廣泛。到2013年，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)約已存入66個(gè)堿性磷酸蛋白晶體結(jié)構(gòu)圖，并且在物種之間磷酸蛋白酶的氨基酸序列同源性很低(30%)，但其四級(jí)結(jié)構(gòu)極大相似。Arai等［10］從中度嗜鹽細(xì)菌鹽單胞菌Halomonassp.593得到堿性磷酸酶蛋白晶體結(jié)構(gòu)，并且從結(jié)構(gòu)上分析該酶能在1～4 mol/L NaCl濃度范圍都能發(fā)揮活性的原因。

該研究前期從硝爾庫(kù)勒鹽湖土樣分離菌株，土樣總鹽為293 g/L，分離培養(yǎng)基中添加NaCl濃度達(dá)20%(W/V)。在堿性磷酸酶篩選過(guò)程中，選用的也是同一鹽濃度。在86株嗜鹽古菌中只篩到8株產(chǎn)堿性磷酸酶菌株，只有1株高產(chǎn)菌株。導(dǎo)致這個(gè)酶活篩選低的原因可能有兩點(diǎn):①磷酸苯二鈉檢測(cè)在該試驗(yàn)中檢測(cè)靈敏度過(guò)低;②培養(yǎng)條件，有文獻(xiàn)報(bào)道低濃度磷能誘導(dǎo)堿性磷酸酶的表達(dá)。該酶活性被胞內(nèi)磷和胞外磷的濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)［4］。但是，在培養(yǎng)過(guò)程中，沒(méi)有考慮到人工設(shè)計(jì)一個(gè)無(wú)磷或低磷環(huán)境。因此，無(wú)法判斷這些保存的菌體是否能產(chǎn)堿性磷酸酶。靈敏的檢測(cè)手段和無(wú)磷的培養(yǎng)條件將是我們繼續(xù)開(kāi)展堿性磷酸酶分離和純化非常關(guān)鍵的步驟。

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