硫化氫對(duì)內(nèi)皮素誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚的作用研究

張駿浩 楊逢永 王雅婧 王其新

硫化氫對(duì)內(nèi)皮素誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚的作用研究

張駿浩 楊逢永 王雅婧 王其新

目的 探討硫化氫（H2S）對(duì)內(nèi)皮素誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚的影響。 方法 取64只成年雄性大鼠，體質(zhì)量180～200 g，隨機(jī)分為4組：正常組10只、假手術(shù)組10只、內(nèi)皮素誘導(dǎo)心肌肥厚模型組22只、內(nèi)皮素誘導(dǎo)心肌肥厚+H2S（56μmol/kg）治療組22只。4周之后檢測左心室質(zhì)量指數(shù)、心肌細(xì)胞肥大形態(tài)學(xué)指標(biāo)、心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)以及心肌羥脯氨酸含量等各項(xiàng)心肌肥厚指標(biāo)。 結(jié)果 與單純心肌肥厚組相比，H2S治療組左心室質(zhì)量下降21.4%，左心室質(zhì)量指數(shù)下降5.97%，心肌細(xì)胞最短徑下降12.5%，心肌細(xì)胞橫斷面面積下降10.8%，心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)下降22.3%，心肌羥脯氨酸含量下降31.3%（P均＜0.05）。 結(jié)論 H2S可降低內(nèi)皮素誘導(dǎo)的心肌肥厚大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)，改善心肌細(xì)胞肥大，降低心肌膠原蛋白水平以及心肌纖維化，為治療心肌肥厚提供思路。

硫化氫；心肌肥厚；左心室質(zhì)量分?jǐn)?shù)；心肌纖維化

老年心臟病患者常伴有心肌肥厚的病理改變，臨床和基礎(chǔ)研究已證實(shí)心肌肥厚是老年人心臟衰竭和致死性心律失常發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因子［1］。心肌肥厚是在長期壓力負(fù)荷過重的情況下緩慢發(fā)生的代償性病理改變，心肌質(zhì)量增加，收縮力加強(qiáng)，以維持正常的血液循環(huán)［2-3］。但這種代償功能的改變也有其不利之處，主要因?yàn)榉蚀蟮男募⌒柩踉黾樱跔顒?dòng)脈的供血量往往不能滿足，造成心肌相對(duì)缺血，最后導(dǎo)致心肌收縮力的減退。導(dǎo)致心肌肥厚的病理性刺激因素主要有機(jī)械刺激信號(hào)和神經(jīng)體液因子。內(nèi)皮素作為一種具有血管收縮作用的活性肽，在心肌細(xì)胞肥大的過程中起到了重要的作用。硫化氫（H2S）是繼一氧化氮和一氧化碳之后發(fā)現(xiàn)的新型氣體信號(hào)分子［4］，它在體內(nèi)多種疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要的作用［5-6］。本研究借助內(nèi)皮素誘發(fā)心肌肥厚大鼠模型，觀察H2S治療對(duì)內(nèi)皮素誘發(fā)的大鼠心肌肥厚的影響，為治療心肌肥厚提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 取64只成年雄性大鼠，體質(zhì)量180～200 g，將其隨機(jī)分為4組：正常組10只，假手術(shù)組10只，內(nèi)皮素誘導(dǎo)心肌肥厚模型組（單純心肌肥厚組）22只，內(nèi)皮素誘導(dǎo)心肌肥厚+H2S（56μmol/kg）治療組（H2S治療組）22只。內(nèi)皮素誘導(dǎo)大鼠心肌肥厚模型的建立：成年雄性SD大鼠清醒狀態(tài)下每日經(jīng)尾靜脈注入濃度為8～10 mol/L內(nèi)皮素-1（ET-1）2 ml，2次/ d，分別于10：00和20：00給藥，連續(xù)給藥4周［6-8］，采用超聲心動(dòng)圖檢測左室舒張內(nèi)徑（LVSEV），左室收縮末內(nèi)徑（LVEDD），左室舒張末容積（LVEDV），左室收縮末容積（LVESV），左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），左室縮短分?jǐn)?shù)（LVFS）均符合心肌肥厚診斷標(biāo)準(zhǔn)［7-9］。

1.2 方法 正常組大鼠每日2 ml純凈水灌胃治療；假手術(shù)組、單純心肌肥厚組每日2 ml生理鹽水灌胃；H2S治療組每日2 ml NaHS生理鹽水腹腔注射治療，治療4周后，觀察左心室質(zhì)量指數(shù)、心肌細(xì)胞形態(tài)、心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)及心肌羥脯氨酸含量等各項(xiàng)心肌肥厚指標(biāo)。

1.2.1 左心室質(zhì)量指數(shù)的測定：大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，開腹；止血鉗夾住劍突，剪刀沿胸骨左右側(cè)剪開，胸廓前翻，充分暴露胸腔，可見跳動(dòng)心臟，用鑷子稍分離。剪斷上腔靜脈，固定心臟，將注射器針頭插入左心室，先快速灌注生理鹽水150 ml，再灌注多聚甲醛150 ml。先稱量大鼠的體質(zhì)量，取出心臟后修剪心臟，用濾紙吸干上面的水分，用電子天平稱量全心質(zhì)量和左心室質(zhì)量，進(jìn)而計(jì)算左心室質(zhì)量/體質(zhì)量比值的變化。

1.2.2 心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)指標(biāo)的測定：心臟灌流取出心臟后，4%多聚甲醛室溫下固定24 h，用流水輕輕沖洗過夜。經(jīng)固定后的樣本在室溫下梯度酒精脫水：50%乙醇30min—70%乙醇30min—80%乙醇1 h—90%乙醇1 h—95%乙醇1 h—100%乙醇3 h。透明：二甲苯Ⅰ30 min—二甲苯Ⅱ30 min—二甲苯Ⅲ30 min。用熔點(diǎn)60℃～62℃的石蠟浸蠟3次，用相同熔點(diǎn)的石蠟包埋，室溫冷卻后，置于-20℃冷藏。蠟塊切成4μm薄片，45℃水浴展片，撈至載玻片使之鋪平，經(jīng)45℃烤片1 h、60℃烤片2 h，冷卻至室溫。經(jīng)4道二甲苯脫蠟，逐次梯度酒精脫水：無水乙醇5 min，90%乙醇3 min，70%乙醇2 min。ddH2O復(fù)水后進(jìn)行HE染色。石蠟切片 HE染色后，利用圖像分析技術(shù)，采用Bioquant分析軟件檢測心肌細(xì)胞橫切面面積，計(jì)算心肌細(xì)胞直徑的變化。

1.2.3 心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)的測定：切片HE染色后，經(jīng)行天狼星紅染色，在偏光顯微鏡下用 Iamge-ProPlus 5.0圖像分析軟件測定心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)。

1.2.4 心肌羥脯氨酸含量的測定：左心室心肌組織解凍后，濾紙吸干水分后稱重（0.1 g）。勻漿并加生理鹽水至1 mL，4000 r/min離心10 min，棄上清液，加入6 mol/L HCl，置于磨口瓶中125℃水解5 h后，2500 r/ min離心10 min。取1 ml上清液加雙蒸水定容至10 ml，過濾并取濾液1ml，加入0.1mol/L檸檬酸緩沖液0.5 ml，然后加入1 ml 0.05 mol/L氯胺-T溶液，混勻，37℃水浴20min，加3.15mol/L過氯酸1ml，混勻并反應(yīng)5min，加入1ml 10%p-DMAB，100℃沸水浴中顯色3 min，冷卻。空白管調(diào)零，7210分光光度計(jì)于560 nm處測量樣品及標(biāo)準(zhǔn)品吸光度（OD）值。用Excel軟件進(jìn)行作圖，各標(biāo)準(zhǔn)管OD值為y軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為x軸繪制散點(diǎn)圖，并求出各樣本濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 2組大鼠需要進(jìn)行t檢驗(yàn)處理的計(jì)量資料為左心室質(zhì)量指數(shù)、心肌細(xì)胞肥大、心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)以及心肌羥脯氨酸含量，軟件包為SPSS 16.0，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H2S對(duì)左心室質(zhì)量指數(shù)的影響 單純心肌肥厚組大鼠左心室質(zhì)量及左心室質(zhì)量指數(shù)較假手術(shù)組分別升高33.2%、27.0%（P＜0.05）。H2S治療組治療4周后，與單純心肌肥厚組大鼠相比左心室質(zhì)量下降了21.4%、左心室質(zhì)量指數(shù)下降了5.97%（P＜0.05），見表1。

表1 4組體質(zhì)量、左心室質(zhì)量及左心室質(zhì)量指數(shù)的比較

表1 4組體質(zhì)量、左心室質(zhì)量及左心室質(zhì)量指數(shù)的比較

注：與假手術(shù)組比較，?P＜0.05；與單純心肌肥厚組比較，△P＜0.05

?

2.2 H2S對(duì)心肌細(xì)胞肥大形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響 單純心肌肥厚組大鼠心肌細(xì)胞最短徑較假手術(shù)組升高了46.9%、心肌細(xì)胞橫斷面面積升高了 85.0%（P＜0.05）。H2S治療治療 4周后，與單純心肌肥厚組大鼠相比，心肌細(xì)胞最短徑下降了12.5%、心肌細(xì)胞橫斷面面積下降了10.8%（P＜0.05），見表2。

表2 4組心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)指標(biāo)的比較

表2 4組心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)指標(biāo)的比較

注：與假手術(shù)組比較，?P＜0.05；與單純心肌肥厚組比較，△P＜0.05

組別 心肌細(xì)胞最短徑（μm）心肌細(xì)胞橫斷面面積（μm2）正常組（n=10） 0.52±0.04 0.40±0.03假手術(shù)組（n=10） 0.49±0.04 0.40±0.04單純心肌肥厚組（n=22） 0.72±0.06? 0.74±0.06?H2 S治療組（n=22） 0.63±0.05△ 0.66±0.04△

2.3 H2S對(duì)心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)以及心肌羥脯氨酸含量的影響 與假手術(shù)組比較，單純心肌肥厚組大鼠心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)升高了72.3%、心肌羥脯氨酸含量升高了50%（P＜0.05）。H2S治療4周后，與單純心肌肥厚組大鼠相比，心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)下降了22.3%、心肌羥脯氨酸含量下降了 31.3%（P＜0.05），見表3。

表3 4組心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)及心肌羥脯氨酸含量的比較

3 討論

生成的H2S，其在體內(nèi)的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于其最低毒性濃度，并且它在體內(nèi)多個(gè)系統(tǒng)都具有特定的體內(nèi)調(diào)節(jié)功能［13］，H2S也成為了繼一氧化氮［14］、一氧化碳之后的新型氣體信號(hào)分子。已有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，H2S有保護(hù)心肌以及對(duì)抗心肌增厚的作用［15-16］，本實(shí)驗(yàn)采用外源性的H2S來研究H2S對(duì)左心室質(zhì)量指數(shù)、心肌細(xì)胞肥大、心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)以及心肌羥脯氨酸含量的影響。結(jié)果顯示，與單純心肌肥厚組大鼠相比，H2S治療組反映心肌肥厚的左心室質(zhì)量指數(shù)、心肌細(xì)胞最短徑、心肌細(xì)胞橫斷面面積等指標(biāo)均明顯下降，說明H2S能有效改善內(nèi)皮素誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞的肥大。同時(shí)心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)和心肌羥脯氨酸含量明顯升高，提示心肌間質(zhì)纖維化。眾所周知，MAPK是多種細(xì)胞外信號(hào)引起心肌細(xì)胞增殖肥大和心室重構(gòu)的胞內(nèi)信息傳遞的共同通路。MAPKS 3個(gè)家族成員 ERKs、P38-MAPKs和JNKs均參與了心肌細(xì)胞的肥大反應(yīng)。本研究通過ET-1誘導(dǎo)建立大鼠心肌肥厚模型的，而ET-1通過ETB受體介導(dǎo)的心肌肥大主要是通過ERK和P38-MAPKs實(shí)現(xiàn)的。既往研究證明，給予大鼠心肌細(xì)胞ET-1刺激后，ERK和P38-MAPKs的表達(dá)明顯增加，而JNK的表達(dá)量極低或幾乎不表達(dá)［17-18］。然而本實(shí)驗(yàn)?zāi)壳爸皇潜容^客觀的分析心肌肥厚相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，尚未深入探討上述作用是否通過抑制MAPK-ERK 和P38-MAPKs來實(shí)現(xiàn)，這將在后續(xù)研究中進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，H2S在降低左心室質(zhì)量指數(shù)、改善心肌細(xì)胞肥大、降低心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)以及心肌羥脯氨酸含量方面有很好的作用，這為今后臨床心肌肥厚的防治提供新的思路。

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心肌肥厚是多種心血管疾病早期的一種代償性反應(yīng)，但過度代償則可導(dǎo)致心律失常、心肌供血不足、心功能不全，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，也可造成心血管疾病死亡率的增加。科學(xué)研究表明，如能有效延緩心肌肥厚的發(fā)生就可以降低心血管疾病的發(fā)生［10-11］。目前治療心肌肥厚的藥物多以血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑及血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑類藥物為主，但都有一定程度的不良反應(yīng)［12］。H2S是一種有著臭雞蛋氣味的氣體，一直以來人們都把它當(dāng)做毒性氣體，但是隨著最近的大量研究證實(shí)，在人體及動(dòng)物體內(nèi)存在內(nèi)源性Signal，2010，12（10）：1219-1234.

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Effect of hydrogen sulfide on cardiac hypertrophy rats induced by endothelin

ZHANG Jun-hao. Medical School of Qingdao University，Qingdao 266001，China；YANG Feng-yong.ICU，Laiwu People's Hospital，Laiwu 271100，China；WHANG Ya-jing，WHANGQi-xin.Qingdao University Affiliatel Hospital，Qingdao 266000，China

Objective To evaluate the effect of hydrogen sulfide molecules on cardiac hypertrophy induced by endothelin in rats. M ethods Sixty-four adultmale rats，weighing 180-200 g，were divided into 4 groups random ly with 10 rats in normal group，10 rats in sham group，22 rats in model group（cardiac hypertrophy model induced by endothelin），22 rats in treatment group（cardiac hypertrophy rats induced by endothelin treated with H2S）.After four weeks，left ventricular mass fraction，morphological index of myocardial hypertrophy，myocardial interstitial collagen volume fraction and myocardial hydroxyproline content and other indicators of cardiac hypertrophy were detected. Results Compared with the model group，left ventricular mass reduced by 21.4%，left ventricular mass index reduced by 5.97%，cardiomyocytes shortest diameter reduced by 12.5%，myocardium cell cross section reduced by 10.8%，myocardial interstitial collagen volume fraction reduced by 22.3%，myocardial hydroxyproline content reduced by 31.3%in treatment group（P＜0.05）. Conclusions H2S can lower leftventricularmass fraction，improvemyocardialhypertrophy，reduce myocardial collagen levels and decrease myocardial fibrosis.It can provide ideas for new drug research and development on myocardial hypertrophy.

hydrogen sulfide；cardiac hypertrophy；ventricularmass fraction；myocardial fibrosis

R 332

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.09.010

266001 山東省青島市，青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院（張駿浩）；271100山東省萊蕪市，萊蕪市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（楊逢永）；266000山東省青島市，青島大學(xué)附屬醫(yī)院（王雅婧，王其新）

王其新，Email：wangqx@qdumh.qd.sd.cn

2015-05-24）