影響精氨酸-還原糖模擬體系熒光性晚期糖基化終末產物形成的因素

夏秋琴，呂麗爽

（南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097）

影響精氨酸-還原糖模擬體系熒光性晚期糖基化終末產物形成的因素

夏秋琴，呂麗爽*

（南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097）

目的：通過建立精氨酸-還原糖模擬體系，考察影響該體系熒光性晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）形成的因素。方法：對建立的精氨酸-還原糖模擬體系，采用熒光光譜法（λex/λem=370 nm/440 nm）檢測反應溫度、還原糖濃度、pH值、金屬離子和抑制劑染料木黃酮對AGEs形成的影響；并分析各個影響因素的作用效果。結果：在單個影響因素：反應溫度（121 ℃）、還原糖及其濃度（3 mmol/L的核糖）、pH值（9.2）和金屬離子（Fe3+）作用下，產生熒光性AGEs作用效果最強，9 mmol/L抑制劑染料木黃酮對熒光性AGEs的形成有抑制作用。結論：反應時間、反應溫度、還原糖種類及其濃度、pH值、金屬離子和抑制劑染料木黃酮均對精氨酸-還原糖模擬體系熒光性AGEs的形成有影響，在該模擬體系中，反應時間是影響熒光性AGEs產生最主要的因素，其次為還原糖的種類。

熒光性晚期糖基化終末產物；熒光光譜；精氨酸-還原糖模擬體系；染料木黃酮；還原糖

非酶糖基化反應，也被稱為非酶褐變和美拉德反應，是發生于還原糖和蛋白質的氨基酸基團之間的一類復雜的反應，它對于食品中風味物質、顏色色澤的形成具有重要作用［1］。還原糖和蛋白質發生的連續性非酶糖基化反應會產生中間產物——活性二羰基化合物，包括丙酮醛（methylglyoxal，MGO）和乙二醛（glyoxal，GO）等，進而在此高活性中間產物的誘導下反應形成不可逆轉的晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）［2］。AGEs可通過食物攝入，亦會在體內蓄積［3-4］并導致某些疾病的發生，如糖尿病、動脈粥樣硬化、阿茲海默癥和慢性心臟衰竭等［5-7］。有文獻報道，精氨酸（arginine，Arg）是發生糖基化反應形成體系復雜的AGEs的主要氨基酸，如2003年，Brock等［8］揭示了Arg殘基是核糖核酸酶糖基化的主要位點；另外Lima等［9］等發現由MGO誘導的β-酪蛋白糖基化的位點中也有Arg。

除了糖基化反應主體氨基酸殘基Arg之外，活性羰基、還原糖及還原糖氧化降解產生的二羰基化合物（MGO、GO）在糖基化反應進程中也起到了至關重要作用。活性羰基化合物與游離氨基酸作用會產生一系列小分子的AGEs產物。Arg含有的胍基（-CN3H4）基團會加速精氨酸與還原糖降解產生的活性二羰基化合物MGO作用，產生的產物為Argpyrimidine［10］；Arg與GO作用的產物為（S，S）-1-［4-（acetylamino）-4-carboxy-1-butyl］-2-imino-4-［（Z）-（2-furyl）-methylidene］-5-｛2-［1-［4-（acetylamino）-4-carboxy-1-butyl］-4-［（E）-（2-furyl）methylidene］-5-oxo-1，3-imidazol-2inyl］｝azamethylidene-1，3-imidazolidine（BISARG）［11］。另外，Arg與葡萄糖交聯反應會產生Pentosidine［12］。這些產物的成功分離為AGEs形成途徑和機制提供了重要的信息。

食品中AGEs的形成取決于食物所含的成分以及食物的加工方式［13］。在食品加工過程中，非酶糖基化反應（Maillard反應）賦予了食品色、香、味；同時其復雜的反應也產生了一些有害產物。隨著對Maillard反應產物研究的逐步深入，如何降低有害終產物的產生，改善加工條件成為當前研究的熱點。據文獻報道食品成分［14］，如：蛋白質類別、還原糖種類以及這些成分含量的高低［15］；食品加工的方式［16］，如：加熱、高溫滅菌等；熱處理的時間；食品的酸堿度［17］以及食品中其他配料、天然AGEs抑制劑等都會直接或間接影響蛋白糖基化反應從而對AGEs的產生起到舉足輕重的作用。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

精氨酸 生工生物工程（上海）股份有限公司；葡萄糖、果糖、核糖、半乳糖 上海國藥化學試劑有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 廣東省化學試劑工程技術研究開發中心；染料木黃酮 南京廣潤生物制品有限公司；Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O為分析純。

1.2儀器與設備

FA2104N電子分析天平 上海精密科學儀器有限公司；PHS-3C數字式pH計 上海三信儀表廠；XW-80A微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；HH-S數顯恒溫油浴鍋 金壇市醫療儀器廠；多孔酶標儀 瑞士帝肯貿易有限公司。

1.3.1反應溫度對精氨酸-還原糖模擬體系熒光性AGEs形成的影響

根據文獻［18-19］的測定方法加以引用，用0.2 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）溶解精氨酸、葡萄糖、果糖、核糖和半乳糖，在10 mL樣品管中分別加2 mL精氨酸、2 mL各類還原糖和2 mL PBS，使精氨酸的最終濃度為1 mmol/L，還原糖的最終濃度為1 mmol/L。混勻，于37、60、85、100、121 ℃分別加熱0、15、30、45、60、90、120、240 min，取樣1 mL于2 mL樣品管，－20 ℃保存。解凍后于λex/λem= 370 nm/440 nm測定熒光值。

1.3.2還原糖濃度對精氨酸-還原糖模擬體系熒光性AGEs形成的影響

參照文獻［18-19］的方法加以改進，用0.2 mol/L pH 7.4的PBS溶解精氨酸、葡萄糖、果糖、核糖和半乳糖，在10 mL樣品管中分別加2 mL精氨酸，2 mL各類還原糖和2 mL PBS，使精氨酸的最終濃度為1 mmol/L，還原糖的最終濃度分別為0.5、1、2、3 mmol/L。混勻，于100 ℃分別加熱0、15、30、45、60、90、120、240 min，取樣1 mL于2 mL樣品管，－20 ℃保存。解凍后于λex/λem= 370 nm/440 nm測定熒光值。空白組為2 mL的精氨酸和4 mL的PBS緩沖液，混合均勻。

1.3.3pH值對精氨酸-還原糖模擬體系熒光性AGEs形成的影響

據文獻［18-19］的檢測方法加以引用，分別用0.2 mol/L pH 4.0、6.5、7.4、9.2的PBS溶解精氨酸、葡萄糖、果糖、核糖和半乳糖，在10 mL樣品管中分別加2 mL精氨酸、2 mL各類還原糖和2 mL PBS，使精氨酸的最終濃度為1 mmol/L，還原糖的最終濃度為1 mmol/L。混勻，于100 ℃分別加熱0、15、30、45、60、90、120、240 min，取樣1 mL于2 mL樣品管，－20 ℃保存。解凍后于λex/λem= 370 nm/440 nm測定熒光值。

1.3.4金屬離子對精氨酸-還原糖模擬體系熒光性AGEs形成的影響

圖5為卡箍類半環形薄壁鑄件的澆注系統方案[6]。蠟模起模后，質地較軟。為防止蠟模變形在蠟件上增設了工藝筋。該件底部兩端的熱節通過底部開內澆口消除，但澆口橫截面太小引起了其他部位的縮松。其改進方案為：仍是底部開澆口，通過開側澆口增大有效橫截面積并將2件合1件進行組樹。

根據文獻［18-19］的測定方法改進，用pH 7.4的PBS分別溶解含有Fe3+、Fe2+、Mg2+、Ca2+和Zn2+氯化物，使其濃度均為0.02 mmol/L，以此溶解精氨酸、葡萄糖、果糖、核糖和半乳糖，在10 mL樣品管中分別加2 mL精氨酸，2 mL各類還原糖和2 mL PBS，使精氨酸的最終濃度為1 mmol/L，還原糖的最終濃度為1 mmol/L。混勻，于100 ℃分別加熱0、15、30、45、60、90、120、240 min，取樣1 mL于2 mL樣品管，－20 ℃保存。解凍后于λex/λem= 370 nm/440 nm測定熒光值。空白組是2 mL的精氨酸和2 mL的每組對應的還原糖，再加上2 mL的PBS緩沖液，混合均勻。

1.3.5抑制劑染料木黃酮對精氨酸-還原糖模擬體系熒光性AGEs形成的影響

依據文獻［18-19］的方法加以改進，用0.2 mol/L pH 7.4的PBS溶解精氨酸和核糖，在10 mL樣品管中分別加2 mL精氨酸、2 mL核糖，使精氨酸的最終濃度為1 mmol/L，還原糖的最終濃度為1 mmol/L，再加2 mL用DMSO溶解的染料木黃酮，使其濃度分別為1.5、3、6、9 mmol/L。混勻，于100 ℃分別加熱0、15、30、45、60、90、120、240 min，取樣1 mL于2 mL樣品管，－20 ℃保存。解凍后于λex/λem= 370 nm/440 nm測定熒光值。以抑制率反映染料木黃酮對熒光性AGEs的抑制作用。

式中：F0為初始熒光值；F為實驗熒光值。

1.4數據分析

采用Excel 2013和Minitab 16軟件進行數據統計分析，Excel 2013軟件用于分析實驗所測得的熒光性AGEs；Minitab 16軟件用于分析各個影響因素的作用效果，其中每組實驗數據均做3 組平行，測定結果以平均值表示。

2　結果與分析

2.1反應溫度對精氨酸-還原糖模擬體系產生熒光性AGEs的影響

圖1　反應溫度對熒光性AGEs生成的影響Fig.1 Effect of reaction temperature on the formation of fluorescent AGEs

由圖1可知，反應溫度（37～121 ℃）對精氨酸與各個還原糖模擬體系中熒光性AGEs的形成亦存在顯著性（P≤0.05）影響，特別是溫度高于85 ℃以后。隨著反應溫度的升高，熒光性AGEs產生的量增加，而低于60 ℃在240 min內幾乎沒有熒光性AGEs的產生。另外，核糖和果糖誘導精氨酸產生的熒光性AGEs的量較為接近，且高于相應的葡萄糖和半乳糖，而葡萄糖和半乳糖誘導的精氨酸的量相當，但是比較低。

2.2還原糖濃度對精氨酸-還原糖模擬體系產生熒光性AGEs的影響

圖2　還原糖濃度對熒光性AGEs生成的影響Fig.2 Effect of reducing sugar concentration on the formation of fluorescent AGEs

由圖2可知，精氨酸-還原糖模型中，各種還原糖（葡萄糖、果糖、核糖和半乳糖）和精氨酸反應產生的熒光性AGEs的量均隨著還原糖濃度的增大而增加。其中在精氨酸-核糖模型中，熒光性AGEs的強度是最高的，其他3 種糖誘導產生熒光性AGEs量相差不大，依次為果糖、葡萄糖、半乳糖；當濃度為3 mmol/L、反應時間為240 min時，核糖誘導產生的AGEs量約為其他3 種糖的2 倍。因為核糖為五碳糖，反應速率比六碳糖的葡萄糖等還原糖快［20］。此外，在精氨酸-還原糖模型中，隨著時間的延長，各模型產生的熒光性AGEs的量呈逐漸遞增的趨勢。

2.3pH值對精氨酸-還原糖模擬體系產生熒光性AGEs的影響

圖3　pH值對熒光性AGEs生成的影響Fig.3 Effect of pH on the formation of fluorescent AGEs

由圖3可知，pH值（4.0、6.5、7.4和9.2）越接近堿性，體系的熒光強度就越高；酸性條件pH 4.0條件下幾乎不產生熒光性AGEs，文獻［21］報道說在偏酸性環境中，N-葡萄糖胺容易被水解因此不利于反應的進行；而堿性條件pH 9.2的熒光性AGEs則隨著時間的延長不斷增強。此外，模型中以精氨酸-核糖模型反應最強烈，其次分別為果糖、半乳糖和葡萄糖模型。

2.4金屬離子對精氨酸-還原糖模擬體系產生熒光性AGEs的影響

圖4　金屬離子對熒光性AGEs生成的影響Fig.4 Effect of metal ions on the formation of fluorescent AGEs

由圖4可知，5 類金屬離子對體系中熒光性AGEs的產生作用效果不一。其中，在4 個還原糖模擬體系下，Zn2+對體系熒光性AGEs的產生起抑制作用；Ca2+的作用效果并不明顯。在精氨酸-核糖和精氨酸-果糖體系，金屬離子Fe3+、Mg2+和Fe2+的存在對體系熒光性AGEs的產生有促進作用，而在精氨酸-半乳糖體系，只有Fe3+對熒光性AGEs起促進作用。而Mg2+在精氨酸-葡萄糖體系中起輕微抑制作用。Kwak等［22］的研究也表明Fe3+和Fe2+會促進酶促反應的進行，而Ca2+作用效果不明顯；文獻［23-24］報道稱過渡金屬離子如Fe3+和Fe2+等會通過氧化途徑和催化作用形成自由基從而對熒光性AGEs的產生起到促進作用。

2.5抑制劑染料木黃酮對精氨酸-核糖模擬體系產生熒光性AGEs的影響

圖5　抑制劑染料木黃酮濃度對熒光性AGEs生成的影響Fig.5 Effect of genistein on the formation of fluorescent AGEs

由圖5可知，抑制劑染料木黃酮對精氨酸-核糖體系產生的熒光性AGEs有抑制作用。在反應240 min之內，染料木黃酮的抑制效果隨其濃度的增加而加強，在精氨酸-核糖模型中，當反應時間達到240 min、染料木黃酮濃度為1.5、3、6、9 mmol/L時，對熒光性AGEs的抑制率分別達68%、79%、88%和95%。說明染料木黃酮對于熒光性AGEs有顯著抑制作用。Jung等［25］通過熒光檢測的方法尋找AGEs受體的阻斷劑，在檢測了50 個樣品之后，發現染料木黃酮可以阻止AGE-RAGE的交聯，并且隨著染料木黃酮劑量的增加，其阻斷程度也呈線性增加。因此，表明染料木黃酮可以作為斷裂劑起到阻斷AGEs交聯的作用。

2.6影響熒光性AGEs形成的因素及其交互作用分析

影響精氨酸-還原糖模擬體系熒光性AGEs形成的因素及其交互作用如表1所示。在精氨酸-還原糖模擬體系中，反應時間是影響其產生熒光性AGEs最主要的因素，而還原糖種類則屈居第二，與反應時間所占比例相比，還原糖種類要低很多。此外，pH值、還原糖濃度、金屬離子以及反應溫度對體系熒光性AGEs的產生所占比例都不是很高，并且相差不大。雖然抑制劑染料木黃酮可以明顯抑制熒光性AGEs的產生，但與反應時間相比，染料木黃酮所占比例不高。此外，在交互作用中，反應時間與反應溫度的交互作用對體系熒光性AGEs的產生作用效果比較高。

3　結 論

精氨酸-還原糖模擬體系在加熱條件下會產生一系列有熒光性吸收的AGEs，一些影響因素，如反應溫度、還原糖濃度、pH值、金屬離子以及抑制劑染料木黃酮對于熒光性AGEs的產生有重要作用，其中，當反應時間一定，反應溫度（37、60、85、100、121 ℃）越高、還原糖濃度（0.5、1、2、3 mmol/L）越高，產生熒光性AGE的強度就越高；pH值接近9.2時產熒光性AGEs比較（pH 4.0、6.5、7.4）多；此外，抑制劑染料木黃酮對熒光性AGEs的形成有抑制作用。

在反應時間、反應溫度、還原糖濃度、pH值、金屬離子以及抑制劑染料木黃酮等影響因素和交互作用中，反應時間是影響精氨酸-還原糖體系形成熒光性AGEs的最重要因素，其次為還原糖種類。其他作用因素，如反應溫度、pH值、金屬離子、還原糖濃度以及抑制劑染料木黃酮均對熒光性AGEs的形成有作用，但作用程度相較反應時間低。

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Factors Influencing the Formation of Fluorescent AGEs in Arginine-Reducing Sugar Model System

XIA Qiuqin， L? Lishuang*
（Ginling College， Nanjing Normal University， Nanjing 210097， China）

Purpose： To investigate the factors infl uencing the formation of fl uorescent AGEs in Arg-reducing sugar model system. Methods： The infl uencing factors including temperature， reducing sugar concentration， pH， metal ion and genistein concentration were detected by fl uorescence spectrometry， （λex/λem= 370 nm/440 nm）. Results： Based on the preliminary one-factor-at-a-time experiments， a reaction temperature of 121 ℃， addition of 3 mmol/L ribose as a reducing sugar， pH 9.2 and the presence of Fe3+were the best conditions for the formation of fl uorescent AGEs， whereas 9 mmol/L genistein could effectively inhibit the formation of fl uorescent AGEs. Conclusion： Reaction temperature， reducing sugar concentration， pH，and metal ion have a signifi cant effect on the formation of fl uorescent AGEs， and genistein could inhibit the fl uorescent AGEs. Among these influencing factors reaction time has the greatest influence on the formation of fluorescent AGEs，followed by reducing sugar type.

fl uorescent advanced glycation end products （AGEs）； fl uorescence spectrometry； arginine-reducing sugar model system； genistein； reducing sugar

TS201.2

A

1002-6630（2015）15-0050-06

10.7506/spkx1002-6630-201515011

2014-09-29

江蘇省基礎研究計劃（自然科學基金）資助項目（BK2012850）；浙江省自然科學基金項目（LY12C15001）

夏秋琴（1989—），女，碩士，研究方向為食品科學。E-mail：Shally0809@126.com

呂麗爽（1969—），女，副教授，博士，研究方向為食品化學和功能性食品。E-mail：lishuanglv@126.com