微波輔助酶催化甜菊苷的轉苷和水解

萬會達

（食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學化學與材料工程學院，江蘇無錫214122）

微波輔助酶催化甜菊苷的轉苷和水解

萬會達

（食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學化學與材料工程學院，江蘇無錫214122）

分別研究了微波輔助α-環糊精轉移酶（α-CGTase）催化甜菊苷（St）轉苷，和β-半乳糖苷酶催化St水解的反應。實驗表明，微波能夠加速來源于Paenibacillus macerans JFB05-01的α-CGTase催化St轉苷反應，催化效率提高了21.7倍；但微波對β-半乳糖苷酶催化St的水解反應的影響較小。α-CGTase的加酶量為1 000 U/g時，反應1 min，St的轉化率高達71.6%，St-Glc 1的產率為23.7%。

微波；甜菊苷；轉苷；水解

甜菊糖是一類從甜葉菊葉子中提取的高甜度、低熱值甜味劑，是一種非常理想的蔗糖替代品，被譽為世界“第三類糖源”［1］。同時其還兼具生物活性和藥用價值，可以輔助治療高血壓、高血糖、糖尿病，預防動脈硬化、齲齒，也有消炎、抗菌、抗癌和增強免疫力等功效［2-4］。甜菊糖主要由9種甜味成分組成，均含有相同的苷元——四環二萜類化合物甜菊醇（steviol），僅C19和C13位上連接不同數量的葡萄糖基或鼠李糖基［5］。甜菊糖中含量最高的為甜菊苷（13-［（2-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl）oxy］kaur-16-en-18-oic acid，β-D-glucopyranosyl ester，stevioside，St）。甜菊糖雖然優點眾多，但也存在缺陷，亟需解決，首當其沖就是后苦澀味。與精制、復配、加入掩蓋劑等手段相比，酶催化轉苷法可以從分子層面上去除后苦澀味［6］。分子結構中糖基位置、數目、種類三者共同決定甜菊糖的甜味特質，C13槐糖基是甜味的主要功能基團。對甜度和甜味有利的連接糖基種類的順序是：果糖基>葡萄糖基>鼠李糖基或半乳糖基>其他疏水性分子基團［7］。此外利用糖基水解酶可以選擇性催化水解甜菊糖結構中已有的糖基，可以得到多種自然界中稀有次級苷，如懸鉤子苷、異甜菊醇等，次級苷可以進一步衍生化，合成其他功能性糖苷［8-9］。

微波是一種波長介于1 mm～1 m的電磁波。微波輻射（Microwave Irradiation，MI）作為一種加熱方式，具有均勻、快速、高效等特點，已在提取、干燥、冶金、消解、滅菌、化學等領域中廣泛應用［10-13］。與常規加熱（Conventional Heating，CH）相比，微波輻射不僅能減少催化劑用量，加快反應速度，甚至改變選擇性［14-16］。這可以歸結為熱效應和非熱效應：熱效應是指微波輻射使反應物溫度升高，從而加快反應速度的現象；非熱效應是指除加熱使溫度升高帶來的影響以外，MI對某些反應具有提高平衡轉化率、減少副產物、改變產物選擇性等無法用單純的致熱效應來解釋的其它效應［17］。如微波輻射下，嘧啶被選擇性合成6-取代蝶呤，而在常規加熱下產物則以7-取代蝶呤為主［18］。微波輻射也能促進糖苷酶催化糖苷合成或水解反應，如在300 W下，來源于Pyrococcus furiosus的β-葡萄糖苷酶催化oNPG，水解活性提高了2.3萬倍［19-20］。

已有的研究大多是使用家用微波爐或是在類似工作原理的微波反應器中進行，均為非連續多模微波輻射，微波場密度低，功率分布不均勻，導致實驗重現性差，非熱效應不明顯。本文初探了單模連續微波輻射輔助3種糖苷酶分別催化甜菊苷水解和轉苷反應，如圖1所示。

圖1　微波輔助糖苷酶催化甜菊苷水解和轉苷反應圖示Fig.1Schematic illustration of microwave-assisted enzymatic transglycosylation and hydrolysis of stevioside

1　試劑與儀器

甜菊苷（純度95%，HPLC），購于GLG生命科技集團；甜菊苷標準品（純度98.5%，HPLC），由常州市牛塘化工廠有限公司惠贈；懸鉤子苷標準品（純度98.2%，HPLC），由廣西師范大學陳全斌課題組惠贈；甜菊醇標準品（純度98.5%，HPLC），作者所在實驗室自制；來源于Bacillus Subtilis的α-中溫淀粉酶（4 000 U/g），購于無錫雪梅酶制劑有限公司；來源于軟化類芽孢桿菌Paenibacillus macerans JFB05-01的α-CGTase（187 U/mL），來源于Sulfolobus sp.的β-半乳糖苷酶（770 U/mL），來源于Aspergillus sp.的β-半乳糖苷酶（14 kU/g），由江南大學吳敬課題組提供；玉米淀粉，購于作者所在地超市；鄰硝基苯酚（oNP，純度99%），購于上海晶純生化科技股份有限公司；鄰硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（oNPG，純度99%），購于上海寶曼生物科技有限公司；有機純試劑（AR），購于中國醫藥（集團）上?；瘜W試劑公司；乙腈（色譜純），購于美國J.T bakter公司；超純水，作者所在實驗室自制。

Discover微波反應器，購于美國CEM公司；WSC21070A空氣壓縮機，購于上?；垴Y機電有限公司；HZ-8812S-B往復式水浴搖床，購于太倉市華利達實驗設備有限公司；D-2000 Elite日立HPLC，購于天美（中國）科學儀器有限公司；DKB-501A超級恒溫水槽，購于上海森信實驗儀器有限公司；81-2型磁力攪拌器，購于上海司樂儀器有限公司；紫外可見分光光度計，購于北京普析通用儀器有限公司；2695型液相色譜儀（二極管陣列檢測器996），MALDI SYNAPT QTof MS液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜儀，購于美國Waters公司。

2　實驗方法

2.1酶活測定

α-CGTase環化酶活的測定：用磷酸緩沖液（pH 6.0，50 mmol/L）將酶液稀釋一定倍數；在5 mL的離心管中加入980 μL麥芽糊精溶液（質量分數1%），放入40℃水浴鍋中恒溫10 min；加入20 μL稀釋到一定倍數的酶液，反應10 min后加入1 mL HCl（1 mol/L）終止反應；10 min后向反應液中加入1 mL甲基橙顯色（0.1 mmol/L，緩沖液配制同上），室溫靜置15～20 min后用分光光度計在505 nm測定吸光度，根據標準α-CD標準曲線計算酶活。空白對照：先加入1 mol/L的HCl終止反應，而后再加酶液，其他條件相同。α-CGTase酶活定義：每分鐘釋放1 μmol α-CD所需要的酶量定義為1個酶活單位。

來源于Aspergillus sp.的β-半乳糖苷酶酶活測定：在5 mL的離心管中加入1.8 mL醋酸緩沖液（pH 4.6），再加入100 μL稀釋100倍的酶液（空白不加酶），37℃下預熱10 min；加入oNPG（20 mmol/ L）底物100 L，計時反應10 min；加入1 mL Na2CO3（1 mol/L）終止反應；在420 nm處測定其吸光度，根據鄰硝基苯酚oNP標準曲線（y=0.229 2×OD值，R2= 0.999 2）計算酶活。酶活（U）定義為在上述反應條件下每分鐘生成1 μmol oNP所需要的酶量。

來源于Sulfolobus sp.的β-半乳糖苷酶酶活測定：將緩沖液替換成pH 6.0、50 mmol/L的磷酸緩沖液，80℃，其他測定條件同上。

2.2微波輻射輔助甜菊苷的轉苷反應

稱取2 g淀粉加入100 mL水調成糊狀，放入90℃水浴中不斷攪拌，直至成糊。將燒杯放入70℃水浴中恒溫后加入2 mL α-淀粉酶液（4 U/mL）不斷攪拌，液化30 min。煮沸3 min滅活，冷卻后定容至100 mL。離心后上清液備用，沉淀為未溶解的淀粉，恒質量計算淀粉水解液的真實濃度。分別移取10 mL St溶液（20 mg/mL）和10 mL淀粉水解液（20 mg/mL）于圓底燒瓶中，放入微波反應器；選擇恒溫模式，在一定溫度下預熱30 min后，改成恒定功率模式（20 W），加入α-CGTase（10 U/g）后反應1 min，并通過同步冷卻控制溫度恒定；將反應液煮沸滅除酶活，離心取上清液；HPLC測定甜菊苷的含量，計算St轉化率。

常規加熱采用水浴加熱，其他反應條件同上。

2.3微波輻射輔助甜菊苷的水解反應

移取10 mg/mL St溶液于圓底燒瓶，放入微波反應器；選擇恒溫模式，在一定溫度下預熱30 min，設定微波加熱模式，加入β-半乳糖苷酶100 U/g，反應數分鐘；取樣作HPLC分析，計算St轉化率。

常規加熱采用水浴加熱，其他反應條件同上。所有實驗均做3次平行。

2.4產物分析

LC-MS分析轉苷產物（St-Glc）組成［21］；根據HPLC計算St轉化率和轉苷產物產率：色譜柱為氨基柱（APS-2 HYPERSIL，250 mm×4.6 mm，Thermo，United States），檢測波長210 nm；乙腈/水梯度洗脫：V（乙腈）∶V（水）=75∶25（2 min）到V（乙腈）∶V（水）= 50∶50（25 min），體積流量1 mL/min。St轉化率

式中：C0表示St初始質量濃度（mg/mL），Ct表示t h時反應混合物中St的質量濃度（mg/mL）。根據HPLC外標曲線計算St的濃度。轉苷產物的產率根據峰面積歸一化計算得到。

水解產物分析：色譜柱為C18柱，檢測波長為210 nm；乙腈/水梯度洗脫：V（乙腈）∶V（水）=15∶85（2 min）到V（乙腈）∶V（水）=81∶18（25 min），體積流量1 mL/min；根據外標曲線求得懸鉤子苷及甜菊醇產率。

3　結果與討論

3.1微波輻射對糖苷酶催化甜菊苷反應的作用

恒定功率和溫度，考察3種糖苷酶催化St轉苷和水解反應。來源于Paenibacillus macerans JFB05-01的α-CGTase催化St的轉苷反應［21］，來源于Aspergillus sp.的β-半乳糖苷酶可以催化St水解制備懸鉤子苷［9］，來源于Sulfolobus sp.的β-半乳糖苷酶可以催化St水解制備甜菊醇［22］。相同條件下，與常規加熱相比，微波功率為15 W時，來源于Paenibacillus macerans JFB05-01的α-CGTase催化St的轉化率提高了21.7倍，1 min St的轉化率達32.6%（圖2）。而其他兩種β-半乳糖苷酶在MI下并沒有表現出較高的催化活性，MI下反應1 min，未檢測出產物；延長反應時間至0.5 h后與相同條件下CH相比，St的轉化率僅提高1%～3%。

圖2　微波輻射輔助糖苷酶催化甜菊苷轉苷和水解反應Fig.2Microwave-assisted enzymatic transglycosylation and hydrolysis of stevioside

更換其他兩種MI模式，繼續考察來源于Sulfolobus sp.的β-半乳糖苷酶催化St水解反應。圖3（a）為恒溫模式（時間延長至2 h）；圖3（b）表示恒定功率下升溫模式（從25℃升至75℃）。由圖3可知，MI對來源于Sulfolobus sp.的β-半乳糖苷酶催化水解反應的加速作用仍然較弱。

圖3　微波輻射輔助來源于Sulfolobus sp.的β-半乳糖苷酶催化甜菊苷的水解反應Fig.3Hydrolysis of stevioside using the β-galactosidase from Sulfolobus sp.under microwave irradiation

3.2微波輔助α-CGTase催化甜菊苷的轉苷反應

如圖4所示，虛線表示St的轉化率，實線表示各種轉苷產物的產率；圖4（a）是60℃，10 W，淀粉水解液10 mg/mL，St 10 mg/mL，10 U/g；圖4（b）是60℃，淀粉水解液10 mg/mL，St 10 mg/mL，10 U/ g，1 min；圖4（c）是20 W，淀粉水解液10 mg/mL，St 10 mg/mL，10 U/g，1 min；圖4（d）是20 W，55℃，St 10 g/mL，10 U/g，1min；圖4（e）是20 W，55℃，淀粉水解液10 mg/mL，St 10 mg/mL，10 U/g，pH 5.0 50 mmol/L醋酸緩沖液，pH 6～8 50 mmol/L磷酸緩沖液；圖4（f）是20 W，55℃，m（淀粉水解液）∶m（St）= 1∶1，10 U/g；圖3（g）是20 W，55℃，淀粉水解液10 mg/mL，St 10 mg/mL，1 min。

圖4　微波輻射下α-CGTase催化St轉苷反應條件優化Fig.4Optimalreactionconditionsforstevioside transglycosylationwithα-CGTaseunder microwave irradiation

以St轉化率和產物中味質最佳的St-Glc 1為指標（Glc表示葡萄糖基，數字表示轉苷個數），優化微波輔助α-CGTase催化St轉苷反應。反應1 min，轉苷反應基本達到平衡，見圖4（a）；高功率和高溫均會降低催化效率，使α-CGTase活性受到抑制或失去，最佳功率和溫度分別為20 W和55℃，見圖4（b）（c）。最優條件下，1 min，20 W，55℃，m（淀粉水解液）∶m（St）=1∶1，以水為溶劑，St初始底物質量濃度最高可達200 mg/mL，加酶量為10 U/g時，最終St轉化率為52.5%，St-Glc 1的產率為21.5%；當加酶量為1 000 U/g，反應1 min，St的轉化率高達71.6%，St-Glc 1的產率為23.7%。與CH相比，達到相同轉化率的反應時間大大縮短，說明MI下更能促進高轉苷產物的生成。

4　結語

本文初探了連續微波輻射對糖苷酶催化St的轉苷和水解反應的影響。微波輻射能夠提高來源于Paenibacillus macerans JFB05-01的α-CGTase催化St轉苷反應的效率。20 W，反應1 min，55℃，m（淀粉水解液）∶m（St）=1∶1，以水為溶劑，St初始底物質量濃度最高可達200 mg/mL，加酶量為10 U/g St時，轉化率為52.5%，St-Glc 1的產率為21.5%；當加酶量為1 000 U/g，反應1 min St的轉化率高達71.6%，St-Glc 1的產率為23.7%。與CH模式下相比，達到相同轉化率的反應時間大大縮短，說明微波輻射下更能促進高轉苷產物的生成。

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Microwave-Assisted Enzymatic Transglycosylation and Hydrolysis of Stevioside

WANHuida
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Chemical and Materials Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Microwave-assisted enzymatic transglycosylation and hydrolysis of stevioside（St）were investigated using α-cyclodextrin glucanotransferase（α-CGTase）and β-galactosidase，respectively. Microwave irradiation could accelerate the transglycosylation of St using α-CGTase extracted from Paenibacillus macerans JFB05-01，and the catalytic efficiency was increased by 21.7 folds. However，little effect was observed when microwave irradiation was applied to the enzymatic hydrolysis of St using β-galactosidase.With 1 000 U/g of α-CGTase was loaded，the conversion of St could reach as high as 71.6%after 1 min and the yield of St-Glc 1 was 23.7%correspondingly.

microwave，stevioside，transglycosylation，hydrolysis

Q684；O629.13；Q556.2

A

1673—1689（2015）12—1338—06

2015-05-04

無錫市科技支撐計劃——社會發展（CSE01N1239）；江南大學青年自主科研課題（1042050205141410）。

萬會達（1984—），男，江蘇鹽城人，工學博士，副教授，主要從事生物催化研究。E-mail：huidawan@jiangnan.edu.cn