M2亞型巨噬細胞對胃癌細胞遷移及上皮-間質轉化的影響*

李 偉，鄭 萍，趙紹林，周 穎，李海寧

(1.江蘇省連云港市第一人民醫院中心實驗室 222001;2.江蘇省連云港市第一人民醫院檢驗科 222001；3.南京醫科大學康達學院醫學檢驗系，江蘇連云港222000)

作為最主要的致死性惡性腫瘤之一，胃癌在我國的發病率和病死率始終居高不下，已成為威脅國民健康的公共衛生事件[1]。目前高轉移率仍然是影響臨床胃癌患者長期生存率的主要因素之一[2]。因此，闡明胃癌轉移相關的病理學機制將是探尋胃癌有效治療靶點的重要途徑。

腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAMs) 是腫瘤微環境中的主要免疫細胞之一。在腫瘤發生、發展的不同時期，TAMs在經典活化 (M1) 與替代活化(M2)等亞型之間發生極化，分別發揮抗腫瘤與促腫瘤作用[3]。目前，腫瘤局部浸潤的M2亞型TAMs已被證實與腫瘤轉移密切相關，并且提示預后不良[4]。上皮-間質轉化 (epithelial-mesenchymal transition,EMT)作為重要的細胞生物學進程之一，在腫瘤轉移的多個環節發揮關鍵作用[5]。發生EMT后的上皮細胞，其表型特性向具有干性、侵襲性、耐藥性及遠端器官轉移性的方向轉化[6]，是誘導腫瘤體內轉移與復發的重要病理學因素。

本研究擬采用磁性活化細胞分選法(MACS)分離獲得胃癌組織及外周血來源TAMs，并對其亞型進行鑒定。在體外共培養體系中，探討胃癌組織來源TAMs (gastric cancer-derived tumor-associated macrophages,GC-TAMs) 對胃癌細胞遷移能力及EMT的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株

采用MACS體外分離GC-TAMs后，培養于含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640中。人胃癌細胞株MKN-28由蘇州大學第一附屬醫院贈予，并以含10% FBS的RPMI1640營養液培養。胃癌組織來源間充質干細胞 (gastric cancer-derived mesenchymal stem cells,GC-MSCs) 參照早期文獻報道的方法進行分離[7]，并以含15% FBS的L-DMEM營養液培養。

1.1.2主要試劑

人腫瘤組織解離試劑盒和人CD14磁珠分選試劑盒均購自德國Miltenyi公司；RPMI1640營養液、FBS和胰酶購自美國Gibco公司；佛波酯(PMA)購自美國Sigma-Aldrich公司；Ficoll-Hypaque(1.077 g)淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；抗人CD204-PE購自美國R&D公司；重組人細胞因子IL-4 (rhIL-4)購自愛必信(上海)生物科技有限公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；RNA逆轉錄試劑盒購自美國Roche Diagnostics公司；RT-qPCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；Transwell小室購自美國Corning公司；抗人CD204-PE抗體及PE同型對照購自美國R&D公司；抗人E-cadherin、vimentin和snail2均購自美國Cell Signaling Technology公司；抗人fibronectin和β-actin購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1GC-TAMs分離培養

選取連云港市第一人民醫院胃癌切除術患者3例，病理確診為胃腺癌，且術前均未接受任何放化療。留取患者癌組織及癌旁組織(距癌變部位5 cm以上，且病理檢查未見癌組織)，取材均獲患者家屬同意并簽署知情同意書。以PBS沖洗清除新鮮癌組織表面血液后，將其剪成1 mm3小塊并浸泡于抗生素溶液。利用gentleMACSTMOcto單細胞解離器(德國Miltenyi公司)及人腫瘤組織解離試劑盒將腫瘤組織解離為具有活性的單細胞懸液。按照人CD14磁珠分選試劑盒說明書操作分離獲得GC-TAMs，同樣方法分離所得癌旁組織來源巨噬細胞設為對照。

1.2.2外周血來源巨噬細胞分離培養

采用Ficoll-Hypaque(1.077 g)淋巴細胞分離液分離獲得3例胃腺癌患者的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)，健康體檢者外周血分離所得PBMCs設為對照。本研究經連云港市第一人民醫院醫學倫理學委員會批準，患者及其家屬知情同意。隨后，利用CD14磁珠陽性分選法從PBMCs中分離CD14+細胞。流式細胞法檢測分選所得細胞中CD14+細胞比例后，將其以5×105/mL的密度接種于6孔板中。50 ng/mL PMA體外刺激CD14+單核細胞24 h后，將其誘導分化獲得巨噬細胞。所得巨噬細胞以20 ng/mL rIL-4繼續刺激培養24 h可誘導獲得M2亞型(陽性對照)。

1.2.3流式細胞檢測

收集GC-TAMs及對應癌旁組織來源巨噬細胞或外周血來源巨噬細胞，以預冷PBS洗滌重懸。將所得細胞懸液與抗CD204-PE抗體于4 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌重懸后上機檢測，分析巨噬細胞免疫表型。

1.2.4RT-qPCR檢測

收集GC-TAMs及對應癌旁組織來源巨噬細胞或外周血來源巨噬細胞，TRIzol裂解收集各組巨噬細胞后抽提RNA以檢測巨噬細胞亞型相關基因。收集GC-TAMs共培養處理的胃癌細胞MKN-28并抽提RNA后，檢測胃癌細胞中EMT相關基因表達情況。利用NanoDrop-2000分光光度計對總RNA的純度和含量進行分析，選擇吸光度 (A260/280 nm)為1.8～2.0的標本開展實驗。按照RNA逆轉錄試劑盒說明書操作將RNA逆轉錄為cDNA。巨噬細胞亞型相關基因及胃癌細胞EMT相關基因引物均采用Primer Software軟件(美國Invitrogen公司)設計，并由上海生工生物技術有限公司合成，見表1、2。qPCR反應混合體系(20 μL)中分別含有2 × SYBR Taq (Tli Plus) 10 μL、10 μmol/L上下游引物各0.4 μL、50 × ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL及cDNA模板2 μL，各qPCR反應均重復3次。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt分析方法計算各基因的相對表達量。

表1 巨噬細胞亞型相關基因擴增引物序列

表2 胃癌細胞EMT相關基因擴增引物序列

1.2.5細胞培養上清液的收集

將體外分離所得GC-TAMs和癌旁組織來源巨噬細胞接種于35 cm2培養瓶中，于5% CO2、37 ℃條件下培養48 h后分別收集細胞培養上清液(GC-TAM-CM組、GC-Mac-CM組)。1 200×g離心10 min去除細胞碎片后以0.22 μm孔徑濾器過濾，分裝后凍存于-140 ℃深低溫冰箱備用。GC-MSC-CM組采用同樣方法收集保存以設為陽性對照，未經過細胞上清處理的為對照組。

1.2.6Transwell遷移實驗

將胃癌細胞MKN-28以4×104個/孔的密度接種于24孔板中的Transwell小室上層(8.0 mm孔徑)，下室加入含20% GC-TAM-CM的無血清營養液。37 ℃培養16 h后，取出Transwell小室，將孔膜上層未遷移的細胞刮除，下層以4.0%多聚甲醛和0.5%結晶紫固定、染色。倒置顯微鏡下觀察并隨機選取8個視野(×200)計數遷移細胞。

1.2.7Western blot檢測

為評價GC-TAMs對胃癌細胞EMT的影響，將MKN-28與20% GC-TAM-CM共培養5 d后，收集腫瘤細胞，裂解液冰上提取蛋白。取等量蛋白在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離蛋白，濕轉法轉至PVDF膜并室溫封閉1 h。加入一抗(抗人E-cadherin、fibronectin、vimentin、snail2和β-actin)后，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min。加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG和兔抗鼠IgG，室溫搖床孵育2 h，TBST洗膜3次，加入ECL試劑顯色。實驗結果采用全自動化學發光凝膠成像系統進行檢測、分析。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 GC-TAMs及癌旁組織來源巨噬細胞亞型鑒定

GC-TAMs中CD204+細胞比例明顯高于癌旁組織來源巨噬細胞，見圖1A。與癌旁組織來源巨噬細胞比較，GC-TAMs中M2亞型相關基因CD163、CD204、CD206、IL-10和CCL-22的表達水平明顯升高，而M1亞型相關基因IL-23 (p19)的表達水平明顯降低，胃癌患者GC-TAMs以促腫瘤作用的M2亞型為主，見圖1B。

2.2 胃癌患者外周血來源巨噬細胞亞型鑒定

胃癌患者外周血來源巨噬細胞CD204+細胞比例明顯高于健康對照組，見圖2A。與健康對照組相比，胃癌患者外周血來源巨噬細胞中CD163、CD204、CD206、IL-10和CCL-22的表達水平明顯升高，IL-23 (p19)的表達水平明顯降低，具有被誘導分化為M2亞型的特性，見圖2B。

A：癌組織及癌旁組織巨噬細胞中CD204+細胞比例；B：癌組織及癌旁組織巨噬細胞中M1/M2亞型相關基因表達水平；P：患者；T：癌組織；N：癌旁組織；*:P<0.05，**:P<0.01。

2.3 M2亞型GC-TAMs對胃癌細胞遷移的影響

Transwell遷移實驗結果顯示，與癌旁組織來源巨噬細胞相比，GC-TAMs可明顯促進細胞的體外遷移，差異有統計學意義(P=0.004)。與對照組相比，GC-MSCs顯示出較強的促胃癌細胞遷移的作用，差異有統計學意義(P=0.007)，GC-TAMs對胃癌細胞遷移的誘導作用與GC-MSCs相比更強，差異有統計學意義(P=0.009)，見圖3。

2.4 M2亞型GC-TAMs對胃癌細胞EMT的影響

GC-TAM-CM組胞體伸縮拉長、細胞間分散程度增加，其間質樣細胞形態改變程度比GC-MSC-CM組更強，而GC-Mac-CM組未發生明顯改變，見圖4。

A：胃癌患者外周血來源巨噬細胞中CD204+細胞比例；B：胃癌患者外周血來源巨噬細胞中M1/M2亞型相關基因表達水平；Ctrl：健康對照組；P：患者；rhIL-4：陽性對照；*：P<0.05，**：P<0.01。

圖2 胃癌患者外周血來源巨噬細胞亞型鑒定

**：P<0.01。

圖4 各組細胞鏡下形態

2.5 GC-TAMs對胃癌細胞EMT相關蛋白和基因表達的影響

Western blot檢測結果顯示，與對照組比較，GC-TAM-CM組細胞EMT相關蛋白fibronectin、vimentin和snail2的表達明顯上調(P<0.05)，GC-TAM-CM組細胞EMT相關蛋白fibronectin、snail2表達明顯高于GC-MSC-CM組(P<0.05)，見圖5。RT-qPCR檢測結果顯示，與對照組相比，GC-TAM-CM組細胞EMT相關基因fibronectin、vimentin和snail2的表達明顯上調，而E-cadherin表達則明顯下調，差異有統計學意義(P<0.05)；GC-TAM-CM組細胞EMT相關基因fibronectin、vimentin表達明顯高于GC-MSC-CM組(P<0.05)，見圖6。

*：P<0.05，**：P<0.01。

*：P<0.05，**：P<0.01。

3 討 論

目前，轉移與復發仍然是胃癌患者病死率居高不下的主要原因[8]。研究證實，胃癌微環境中大量存在的諸如血管內皮生長因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)、金屬基質蛋白酶在內的分泌因子及信號通路效應分子等均具有促進腫瘤轉移基質形成和腫瘤細胞遠端器官轉移的作用[9]。胃癌細胞與微環境基質細胞之間的相互作用參與了胃癌轉移的一系列關鍵步驟，包括EMT、血管內滲、循環腫瘤細胞遷移和次級器官轉移等[10]，其有望成為臨床胃癌轉移患者靶向治療的重要靶點。

作為腫瘤微環境中浸潤數量最多的炎癥細胞，TAMs在腫瘤基質重塑、血管生成和化療抵抗等腫瘤病理學進展的多個環節均有重要作用[11]。通過大量分泌細胞因子、趨化因子等，TAMs為腫瘤生長及轉移“創造”免疫抑制微環境，是調節胃癌轉移的重要微環境基質細胞之一[12]。

本研究發現，GC-TAMs中CD204+細胞比例明顯高于癌旁組織來源巨噬細胞。同時，GC-TAMs中CD163、CD204和CD206等M2亞型相關基因的表達水平也明顯高于癌旁組織來源巨噬細胞。提示胃癌微環境中浸潤的TAMs以具有促腫瘤作用的M2亞型為主。同時，胃癌患者外周血來源巨噬細胞的亞型特性與健康對照組也存在明顯差異，胃癌患者外周血單核細胞更“傾向于”極化為M2亞型巨噬細胞。

有研究指出，肺癌細胞可誘導巨噬細胞極化為M2亞型，而其又對肺癌細胞的侵襲、遷移及EMT發揮促進作用[13]。另有研究者在神經母細胞瘤中證實，TAMs對腫瘤細胞增殖能力并無影響，但可通過CXCL2/CXCR2信號通路明顯促進腫瘤細胞侵襲[14]。本研究發現，M2亞型GC-TAMs可促進胃癌細胞遷移，該促進作用比早期文獻報道的GC-MSCs更強。提示胃癌微環境中浸潤的M2亞型巨噬細胞可能在胃癌轉移中發揮重要作用。

作為腫瘤轉移的顯著特征之一，EMT往往伴隨一系列細胞與分子生物學改變，包括：細胞-細胞間黏附性降低、細胞形態發生長梭樣改變及間質樣蛋白的表達上調[15]。本研究觀察到胃癌細胞在GC-TAMs的處理下發生了細胞形態學改變。與對照組相比，GC-TAM-CM組胃癌細胞的形態更加細長，細胞間更加散在分布，且該間質樣形態改變與GC-MSC-CM組相比更為明顯。有研究報道，M2亞型TAMs可部分通過TLR-4/IL-10信號通路促進胰腺癌細胞EMT[16]。另一篇基于卵巢癌的報道指出，腫瘤組織中大量浸潤的TAMs可通過表達EMT驅動因子ZEB1而發揮其促腫瘤及化療抵抗作用[17]。此外，胃癌組織中TAMs的大量浸潤提示患者預后不良，且可通過TGF-β信號通路參與誘導腫瘤EMT[18]。本研究顯示，GC-TAMs可明顯上調胃癌細胞中間質樣基因vimentin、fibronectin和snail2的表達水平。由此證實，胃癌組織中浸潤的M2亞型TAMs可有效促進胃癌細胞發生EMT。

此外，本研究還存在著一定的局限性，如納入研究的胃癌患者病例數較少，且GC-TAMs促進胃癌轉移的相關研究尚缺乏動物體內實驗，這都值得進一步深入研究。

腫瘤微環境細胞通過細胞間相互作用及分泌細胞因子、趨化因子等形式作用于腫瘤細胞，從而對腫瘤發生、發展及耐藥等發揮重要調節作用[19-20]。本研究證實，胃癌微環境中浸潤著大量M2亞型TAMs，該細胞通過誘導胃癌細胞發生EMT而對胃癌轉移發揮促進作用。