內蒙古傳統發酵乳中優質乳桿菌的篩選與鑒定

李周勇，陳云，史玉東，母智深

（內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司研發中心，內蒙古呼和浩特011500）

內蒙古傳統發酵乳中優質乳桿菌的篩選與鑒定

李周勇，陳云，史玉東，母智深*

（內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司研發中心，內蒙古呼和浩特011500）

從內蒙古鄂爾多斯市烏審旗多戶牧民家庭自制的傳統發酵乳制品中，共分離得到36株乳桿菌。經發酵特性試驗篩選，共得到2株同時具有優良產酸和產黏特性的乳桿菌，它們分別是WSQ-18和WSQ-34。經16s rDNA鑒定與API50輔助鑒定，確定WSQ-18為德氏乳酸桿菌乳酸亞種2、WSQ-34為植物乳桿菌1。將兩株乳桿菌與嗜熱鏈球菌進行復配發酵試驗，并與市售酸奶對照，最終確定WSQ-18為試驗菌株，具有作為酸奶發酵劑的可能性。

乳酸桿菌；發酵特性；種屬鑒定；復配

乳酸菌廣泛存在于自然環境中［1］，可以從生鮮乳及傳統發酵乳制品中分離得到，經過進一步純化、培養和傳代，以及和其它具有不同生理特征和發酵代謝特征的菌種混合，從而得到具有不同特征的新型發酵乳制品，然后可進一步應用于工業生產。我國牧區大部分傳統乳制品的制作方法都有其獨特的戶籍性和地域性［2］，因此所產出的發酵乳制品便也同時具備了濃重的地域性特色和獨特風味。

內蒙古鄂爾多斯市烏審旗地區的原住居民千百年來始終沿襲當地傳統而古老的制作方法發酵乳制品［3］。制作工藝簡單、口感純正、組織細膩、產品風味獨具特色，而且在保證其狀態和口感的條件下，還能在自然溫度下保存較長時間。這表明這些傳統發酵乳制品中極有可能含有凝乳狀態穩定、傳代性能好以及產品風味獨特的優良乳酸菌株［4］。在此基礎上，試驗采集了內蒙古鄂爾多斯市烏審旗本地牧民家庭的3份傳統發酵乳制品，希望從中篩選出具有優良產酸、產黏性能的乳桿菌，應用于酸奶的工業化生產。

1材料與方法

1.1試驗材料

1）試驗菌株：36株乳桿菌（采自內蒙古鄂爾多斯市烏審旗多個牧民家庭自制的傳統發酵乳，超低溫冰箱-80℃保存）；現有菌株，嗜熱鏈球菌MN12（蒙牛乳業微生物工作室保存）。

2）培養基：MRS液體培養基、MRS瓊脂培養基、API50CHL培養基（北京陸橋技術有限責任公司）；脫脂乳培養基［12%（g/mL）的脫脂乳、115℃滅菌15 min］。

3）試劑：市售原味酸奶（維多利超市）；脫脂乳粉、甘油、酞批示劑、結晶紫染液、番紅染液、氫氧化鈉等（北京陸橋技術有限責任公司）。

1.2設備

G560E漩渦混合器：美國SCIENTIFIC Instruments公司；CP21GⅡ高速冷凍離心機：日本日立公司；Premium U410超低溫冰箱：美國NBS公司；HV-110高壓滅菌鍋：日本Hirayama公司；SVE-6A1超凈臺：新加坡ES CO公司；LVDV-Ⅱ+P旋轉式粘度計：美國Brookfield公司；Sartorius pH酸度計：北京賽多利斯儀器系統有限公司。

1.3方法

1.3.1乳桿菌的純化

超低溫冰箱-80℃保存的菌株采用脫脂乳培養基傳代活化，之后采用MRS瓊脂培養基劃線接種，于37℃條件下恒溫培養24 h。挑取單菌落于MRS斜面培養基上純培養。對培養物進行革蘭氏染色并鏡檢［5］，直到確認為純菌種。采用MRS半固體培養基穿刺培養，菌種于4℃冰箱內保存備用。

1.3.2優良產酸、產粘菌株的篩選

1）酸度的測定

樣品后熟24h后，采用國標酸堿滴定法測定酸度［6］。

2）黏度的測定

采用LVDV-Ⅱ+P旋轉式粘度計進行一點式測定［7］，根據樣品的黏度范圍最終選擇63號轉子，轉速50 r/min，在測定溫度4℃條件下，測試10 s記數，重復測量3次取算術平均值。黏度單位為mPa·s。

3）發酵特性試驗

凝乳時間：將活化好的菌株以3%的接菌量接種到質量分數為12%的脫脂乳中，于43℃條件下恒溫發酵，每隔0.5 h測定一次樣品的pH。待樣品pH降低到4.6或以下，記錄菌株發酵脫脂乳至凝乳的時間。

產酸速度：分別測定發酵初始和發酵15 h后樣品的pH和酸度，計算平均每小時樣品pH和滴定酸度的變化量即為菌株的產酸速度［8］。

后酸化度：脫脂乳接菌后在培養過程中，分別在第15小時和60小時取出，測定樣品的pH和滴定酸度。在第15小時至60小時的培養過程中，每小時pH和酸度的平均變化量，即表示為后酸化度［9］。

黏度測定：根據試驗結果，保留初始凝乳時間≤6 h的菌株，并選取其中產酸速度快、后酸化程度弱的菌株。待樣品凝乳后取出，破乳并于4℃冰箱內后熟24 h，取出測定黏度。

1.3.3菌株種屬鑒定

1）菌株16 s rDNA鑒定［10］

PCR擴增：PCR體系50μL，反應條件：95℃/5 min， 95℃/40 s，50℃/40 s，72℃/1 min，進行31個循環；72℃/ 5 min，收集PCR產物，由天津生物芯片有限公司測序。

2）菌株API50輔助鑒定［11］

采用16s rDNA進行種屬鑒定，其結果有時可能會與兩個或多個種屬同源性達到95%以上的相同數值，因而無法將菌株鑒定至種。API50CHL適用于乳酸桿菌（Lactpbacillus）和相關菌的鑒定，它是由49種可發酵碳水化合物的API 50 CH試驗條組成的簡易培養基。結合16s rDNA鑒定結果，采用API50CHL鑒定的方法，可將乳桿菌進一步鑒定至種水平。

1.3.4混合發酵試驗［12］

將發酵特性試驗篩選出的優良產酸、產黏乳桿菌與實驗室保留的嗜熱鏈球菌按1∶1的接菌比例，2%的總接菌量進行復配發酵酸奶，以市售原味酸奶為對照。在后熟24 h后測定樣品各項指標的變化，分析評價篩選所得菌株作為酸奶發酵劑的可行性。

1）酸奶的制作流程［13］

牛奶（雜菌＜500 000 CFU/mL，酸度＜18°T）→配入7%的白砂糖，攪拌乳化1 h→均質（壓力為20 MPa）→加熱殺菌（95℃、5 min）→冷卻至43℃→加入發酵劑（接種量3%）→42℃下恒溫發酵→攪拌冷卻→4℃后熟24 h

2）乳清析出率［14］

將100 g酸奶從4℃貯藏條件下取出，立即倒入大漏斗（帶有120目不銹鋼絲網），從下方收集析出的乳清，2 h后稱量乳清重量。

3）黏稠度

采用LVDV-Ⅱ+P型旋轉黏度計進行一點測定，通過試驗最終選擇28號轉子，轉速為50 r/min，在常溫下，測試30 s記數，重復測量3組取平均值。黏度單位為mPa·s。

4）感官評定

由10名蒙牛乳業乳品研發團隊的專業人員組成品評小組，對樣品的總體色澤、滋氣味、組織狀態等進行評分?？偡郑?0分的，定為優質酸奶；總分在80分～90分之間的，定為良質酸奶；總分＜80分的，定為次質酸奶。感官評定標準見表1。

2結果與分析

2.1乳桿菌的分離純化結果

從內蒙古鄂爾多斯市烏審旗多戶牧民家庭自制的傳統發酵乳制品中，通過前期采用革蘭氏染色與過氧化氫酶試驗相結合的方法［16］，初步篩選出62株乳酸菌，經進一步鏡檢純化試驗，確認共得到乳桿菌36株，并依次命名為“WSQ-”系列。

表1　感官評定標準［15］Table 1Standard of organoleptic investigatio

2.2優良產酸、產黏菌株的篩選結果

2.2.1菌株產酸試驗結果

2.2.1.1菌株凝乳時間測定結果

菌株凝乳時間測定結果見表2。

表2　菌株凝乳時間Table 2The time of strain curding

由表2可以看出，活化好的菌株在43℃條件下恒溫發酵，6 h內能發酵脫脂乳至凝乳的菌株共有9株，它們分別是：WSQ-05、WSQ-09、WSQ-13、WSQ-18、WSQ-19、WSQ-24、WSQ-28、WSQ-30、WSQ-34，其中WSQ-09的凝乳時間最短，為3.5 h。因此，保留這9個菌株繼續進行其它產酸試驗。

2.2.1.2菌株產酸速度及后酸化程度測定結果

菌株產酸速度及后酸化程度測定結果見表3。

由表3可以看出，WSQ-09、WSQ-18、WSQ-30、WSQ-34四株菌的產酸速度相對較快，與其它菌株差異顯著。其中，WSQ-09菌株的后酸化程度嚴重，表明在15 h～60 h的培養過程中，產品的pH和酸度的變化過快。因此，選擇后酸化弱的3株菌WSQ-18、WSQ-30、WSQ-34繼續進行產黏試驗。

表3　菌株產酸速度及后酸化程度測定結果Table 3Measurement results of speed of strains produce acid and degree of after acidification

2.2.2菌株產黏試驗結果

經4℃冰箱內后熟24 h，樣品黏度如表4所示。

表4　菌株產黏試驗結果Table 4Test results of strains produce viscosity

由表4可以看出，經4℃條件下后熟24 h后，WSQ-18和WSQ-34發酵樣品的黏度值較大，分別為1 214.5 mPa·s和1 243.4 mPa·s，與WSQ-30樣品的黏度值差異顯著。

根據試驗結果，初步篩選出兩株具有優良產酸和產黏特性的乳桿菌，它們分別是WSQ-18和WSQ-34。試驗最終選擇WSQ-18及WSQ-34作為試驗菌株，進行下一步種屬鑒定及混合發酵試驗。

2.3菌株種屬鑒定試驗結果

2.3.1菌株16s rDNA鑒定結果

經16s rDNA鑒定，結果表明，菌株WSQ-18與德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）的16s rDNA基因序列有著高達99.9%的同源性，可初步確定WSQ-18為德氏乳桿菌。WSQ-34與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）的16s rDNA基因序列有著相同的100%的同源性，暫時無法確定其種屬。

2.3.2菌株API50輔助鑒定結果

菌株WSQ-18和WSQ-34經API 50 CH試驗條的49種可發酵碳水化合物反應所得的生化圖譜如下圖1所示。

圖1　菌株WSQ-18及WSQ-34的API50鑒定圖譜Fig.1API50 identification map of WSQ-18 and WSQ-34

根據WSQ-18、WSQ-34的API50生化圖譜圖，與API50生化圖譜標準對照表比對［17］，最終確定WSQ-18為德氏乳酸桿菌乳酸亞種2（Lactobacillus delbrueckii ssp lactis 2），WSQ-34為植物乳桿菌1（Lactobacillus plantarum 1）。

2.3.3菌株混合發酵試驗結果

菌株混合發酵試驗結果見表5。

表5　混合發酵試驗結果Table 5Test results of mixed fermentation

由表5可以看出，經后熟24 h后，兩個試驗組樣品的乳清析出率略高于對照組，但無顯著差異。WSQ-18+MN12組樣品的黏度與對市售酸奶無明顯差異，WSQ-34+MN12組樣品的黏度低于市售酸奶且差異顯著。經專業人員感官品評，WSQ-18+MN12組與對照組品質接近，均為優質酸奶，WSQ-34+MN12組與對照組相比，品質有所下降，為良質酸奶。因此，根據以上試驗結果，考慮到今后可能用于生產實際，試驗最終選擇WSQ-18（德氏乳酸桿菌乳酸亞種2）為試驗確定菌株。

3結論

試驗從內蒙古鄂爾多斯市烏審旗地區的傳統發酵乳制品中共分離得到36株乳桿菌。經發酵特性試驗篩選，共得到2株具有優良產酸和產黏特性的乳桿菌，它們分別是WSQ-18和WSQ-34。經16s rDNA與API50鑒定，確定WSQ-18為德氏乳酸桿菌乳酸亞種2（Lactobacillus delbrueckii ssp lactis 2）、WSQ-34為植物乳桿菌1（Lactobacillus plantarum 1）。經菌株混合發酵試驗，最終選擇WSQ-18（德氏乳酸桿菌乳酸亞種2）作為目標菌株。

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Screening and Identification for Lactobacillus from Traditional Fermented Dairy in Inner Mongolia

LI Zhou-yong，CHEN Yun，SHI Yu-dong，MU Zhi-shen*
（InnerMongoliaMengNiuDairyIndustry（Group）Co.，Ltd.，R&DCenter，Hohhot011500，InnerMongolia，China）

Test isolated 36 Lactobacillus strains in total from traditional fermented dairy which made by several herding families in Wushen league of Inner Mongolia.By screening of fermentation characteristic test，2 Lactobacillus with excellent acid and viscosity-producing characteristics were got，they were WSQ-18 and WSQ-34.By 16 s rDNA appraisal and API50 auxiliary appraisal，determine the WSQ-18 for Lactobacillus delbrueckii ssp lactis 2，WSQ-34 for Lactobacillus plantarum 1.The mixed fermentation experiment was carried out with two strains of Lactobacillus and streptococcus thermophilus，and compared with commercially available yogurt，determine the WSQ-18 for target strains eventually，as the possibility of yoghurt starter cultures.

Lactobacillus；fermentation characteristics；species identification；compound

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.037

2014-04-15

李周勇（1987—），男（漢），助理工程師，碩士研究生，研究方向：乳制品研究與開發。

母智深，副教授，主要從事乳品營養與工程方面的研究。