5種蛋白酶對豬皮膠原蛋白水解效果的比較研究

肖嵐，李誠，付剛，余霞，杜昕，李曦染

（1.四川農業大學食品學院，四川雅安625014；2.四川旅游學院食品科學系，四川成都610100）

5種蛋白酶對豬皮膠原蛋白水解效果的比較研究

肖嵐1，2，李誠1，*，付剛1，余霞1，杜昕1，李曦染1

（1.四川農業大學食品學院，四川雅安625014；2.四川旅游學院食品科學系，四川成都610100）

以新鮮豬皮為原料，分別采用中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶5種不同蛋白酶水解膠原蛋白，以水解度（DH）和超氧陰離子自由基（O2－·）清除率為指標，根據單因素和正交試驗優化5種蛋白酶水解豬皮膠原蛋白的最適條件；比較分析5種蛋白酶對豬皮膠原蛋白的水解效果。結果表明：5種蛋白酶對豬皮膠原蛋白的水解產物均具有抗氧化性，其水解產物對O2－·清除率依次為：胰蛋白酶水解產物＞中性蛋白酶水解產物＞胃蛋白酶水解產物＞菠蘿蛋白酶水解產物＞木瓜蛋白酶水解產物。

中性蛋白酶；菠蘿蛋白酶；胃蛋白酶；木瓜蛋白酶；胰蛋白酶；水解度；O2－·清除率

豬皮資源價廉易得，豬皮中膠原蛋白含量豐富，但其特殊異味、不良口感、消化率低、加工不便等不利因素嚴重制約了豬皮資源在生物醫用領域、食品領域中的開發利用［1］。膠原蛋白水解產物中存在具有生理活性的肽，其作用包括抗氧化［2-3］、降血壓［4-5］、提高骨密度［6-7］、抑制血小板凝集［2］、降低膽固醇［2］等。目前膠原蛋白活性肽主要是通過體外消化膠原蛋白或明膠來獲得，包括高壓降解，酸、堿降解和酶法降解等；其中酶法制備膠原肽優點最多，如安全性高、生產條件溫和，且選擇不同的蛋白酶、控制反應條件就可以得到特定的活性肽，這為進一步開發高附加值的產品奠定了良好的基礎［8］。但是，長期以來，國內［9-11］對制備膠原蛋白活性肽的蛋白酶的研究一直不夠深入，相關的研究工作也遠遠落后于國外［4-5，12］。

因此，本試驗以豬皮為原料提取膠原蛋白，分別采用中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶對膠原蛋白水解制備抗氧化肽，以水解度（DH）和超氧陰離子自由基（O2－·）清除率為指標，根據單因素和正交試驗優化水解條件，比較分析5種不同蛋白酶在最適水解條件下對豬皮膠原蛋白的水解效果，為其應用于抗氧化肽的制備提供理論參考和試驗參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮豬皮，購于雅安市農貿市場；中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶：廣西南寧龐博生物工程有限公司；其他試劑均符合國家有關標準。

1.2儀器與設備

UV-3200紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；RE-5203旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；BR4i型多功能冷凍離心機：法國THERMO JOUAN公司。

1.3方法

1.3.1豬皮膠原蛋白的制備

根據前期試驗確定的最佳工藝流程制備豬皮膠原蛋白［13-15］。

工藝流程：預處理→脫脂→水解→調節pH→過濾→濃縮→豬皮膠原蛋白

1.3.2豬皮膠原蛋白的水解

稱取一定量的膠原蛋白溶于蒸餾水中，按照試驗設計配制成相應質量濃度的膠原蛋白樣液作為水解底物，分別研究5種蛋白酶對底物的水解效果。選取酶與底物比、pH、水解溫度、底物質量濃度、水解時間5個因素為自變量，以DH和O2－·清除率為應變量，做單因素試驗。根據單因素試驗結果進行豬皮膠原蛋白水解正交試驗，以確定5種蛋白酶水解膠原蛋白的最適條件。

1.3.2.1菠蘿蛋白酶水解條件的研究

確定底物濃度為6%，選擇水解溫度（℃）、pH、水解時間（h）、酶與底物比（U/g）作為試驗因子，以DH和O2－·清除率為指標，采用L9（34）正交試驗設計，確定菠蘿蛋白酶水解膠原蛋白的最適條件。正交試驗表如表1。

表1　菠蘿蛋白酶正交試驗因素水平表Table 1The factors of the orthogonal test of Bromelain

1.3.2.2木瓜蛋白酶水解條件的研究

確定底物濃度為6%，選擇水解溫度（℃）、pH、水解時間（h）、酶與底物比（U/g）作為試驗因子，以DH和O2－·清除率為指標，采用L9（34）正交試驗設計，確定木瓜蛋白酶水解膠原蛋白的最適條件。正交試驗表如表2。

表2　木瓜蛋白酶正交試驗因素水平表Table 2The factors of the orthogonal test of Papain

1.3.2.3中性蛋白酶水解條件的研究

確定底物濃度為6%，選擇水解溫度（℃）、酶與底物比（U/g）、pH、水解時間（h）作為試驗因子，以DH和O2－·清除率為指標，采用L9（34）正交試驗設計，確定中性蛋白酶水解膠原蛋白的最適條件。正交試驗表如表3。

表3　中性蛋白酶正交試驗因素水平表Table 3The factors of the orthogonal test of Neutral Protease

1.3.2.4胰蛋白酶水解條件的研究

確定底物濃度為10%，選擇pH、水解時間（h）、酶與底物比（U/g）、水解溫度（℃）作為試驗因子，以DH和O2－·清除率為指標，采用L9（34）正交試驗設計，確定胰蛋白酶水解膠原蛋白的最適條件。正交試驗表如表4。

表4　胰蛋白酶正交試驗因素水平表Table 4The factors of the orthogonal test of Trypsin

1.3.2.5胃蛋白酶水解條件的研究

確定底物濃度為8%，選擇水解溫度（℃）、酶與底物比（U/g）、pH、水解時間（h）作為試驗因子，以DH和O2－·清除率為指標，采用L9（34）正交試驗設計，確定胃蛋白酶水解膠原蛋白的最適條件。正交試驗表如表5。

表5　胃蛋白酶正交試驗因素水平表Table 5The factors of the orthogonal test of Pepsin

1.3.3指標測定

1.3.3.1DH的測定

采用甲醛滴定法［16-17］。

1.3.3.2O2-·清除率測定

取0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.2）4.5 mL，置于25℃水浴中預熱20min，分別加入1mL樣品和0.4mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后于25℃水浴中反應5 min，加入8 mol/L HCl 1 mL終止反應，299 nm處測定吸光度（Ai），空白對照組以相同體積的蒸餾水代替樣品（A0），清除率計算公式［18］：

式中：A0為空白的吸光度；Ai為樣品吸光度。

1.3.4數據處理與分析

試驗采用3個重復，每個重復平行測定3次，使用SPSS 15.0統計軟件和Excel 2003進行統計分析。

2結果與分析

2.1菠蘿蛋白酶水解豬皮膠原蛋白正交組合優化試驗結果

菠蘿蛋白酶水解豬皮膠原蛋白正交組合優化試驗結果見表6。

表6　菠蘿蛋白酶正交試驗結果及分析Table 6Results and analysis of orthogonal experiments of Bromelain

在菠蘿蛋白酶水解豬皮膠原蛋白正交試驗中，pH、酶與底物比、溫度、時間4個因素對DH的影響順序為：pH＞時間＞酶與底物比＞溫度，但4個因素對DH的影響都不顯著（P＞0.05）；各因素對O2-·清除率的影響順序為pH＞酶與底物比＞時間＞溫度。通過對兩個指標的極差和方差分析，選擇A2B1C1D1為最優組合。驗證試驗測得在最適條件下水解液的DH為5.25%，O2-·清除率為44.49%。

2.2木瓜蛋白酶水解豬皮膠原蛋白正交組合優化試驗結果

木瓜蛋白酶水解豬皮膠原蛋白正交組合優化試驗結果見表7。

表7　木瓜蛋白酶正交試驗結果及分析Table 7Results and analysis of orthogonal experiments of Papain

在木瓜蛋白酶水解豬皮膠原蛋白正交試驗中，pH、酶與底物比、溫度、時間4個因素對DH的影響順序為：溫度＞酶與底物比＞時間＞pH，4個因素對水解度的影響都不顯著（P＞0.05）；各因素對O2-·清除率的影響順序為pH＞酶與底物比＞時間＞溫度。通過對兩個指標的極差和方差分析選擇A3B1C3D3為最優組合。驗證試驗測得在最適條件下水解液的DH為13.28%，O2-·清除率為41.97%。

2.3中性蛋白酶水解豬皮膠原蛋白正交優化試驗結果

中性蛋白酶水解豬皮膠原蛋白正交組合優化試驗結果見表8。

表8　中性蛋白酶正交試驗結果與分析Table 8Results and analysis of orthogonal experiments of Neutral Protease

中性蛋白酶水解豬皮膠原蛋白的正交試驗中，溫度、酶與底物比、pH、時間4個因素對DH的影響順序為：溫度＞酶與底物比＞pH＞時間，但4個因素對水解度的影響都不顯著（P＞0.05）；4個因素對O2-·清除率的影響順序為時間＞酶與底物比＞溫度＞pH。通過對兩個指標的極差和方差分析，選擇A1B1C2D3為水解膠原蛋白的最優組合。驗證試驗測得在最適條件下水解液的DH為8.45%，O2-·清除率為69.79%。

2.4胃蛋白酶水解豬皮膠原蛋白正交組合優化試驗結果

胃蛋白酶水解豬皮膠原蛋白正交組合優化試驗的結果見表9。

表9　胃蛋白酶正交試驗結果及分析Table 9Results and analysis of orthogonal experiments of Pepsin

胃蛋白酶水解豬皮膠原蛋白的正交試驗中，溫度、酶與底物比、pH、時間4個因素對DH的影響順序為：時間＞溫度＞pH＞酶與底物比，但4個因素對水解度的影響都不顯著（P＞0.05）；4個因素對O2-·清除率的影響順序為時間＞酶與底物比＞溫度＞pH值。通過對兩個指標的極差和方差分析，選擇A1B1C2D3為水解膠原蛋白的最優組合。驗證試驗測得在最適條件下水解液的DH為4.47%，O2-·清除率為48.49%。

2.5胰蛋白酶水解豬皮膠原蛋白正交組合優化試驗結果胰蛋白酶水解豬皮膠原蛋白正交組合優化試驗的結果見表10。

表10　胰蛋白酶正交試驗結果及分析Table 10Results and analysis of orthogonal experiments of Bromelain

胰蛋白酶水解豬皮膠原蛋白的正交試驗中，溫度、酶與底物比、pH、時間4個因素對水解度的影響順序為：酶與底物比＞溫度＞pH＞時間；4個因素對O2－·清除率的影響順序為：時間＞酶與底物比＞溫度＞pH。通過對兩個指標的極差和方差分析，選擇組合A1B1C2D3為最優組合。驗證試驗測得在最適條件下水解液的DH為12.15%，O2－·清除率為76.49%。

3結論與討論

1）不同蛋白酶水解豬皮膠原蛋白的最適條件不同，其中菠蘿蛋白酶水解豬皮膠原蛋白的最適條件：時間5 h、溫度45℃、pH3.5、酶與底物比4 000 U/g、底物濃度6%，此時DH 5.25%，O2－·清除率44.49%；木瓜蛋白酶水解豬皮膠原蛋白的最適條件：時間6 h、溫度70℃、pH5、酶與底物比6 250 U/g、底物濃度6%，此時DH13.28%，O2－·清除率41.97%；中性蛋白酶水解豬皮膠原蛋白的最適條件：時間5h、溫度30℃、pH7.5、酶與底物比2000 U/g、底物濃度6%，此時DH8.45%，O2－·清除率69.79%；胃蛋白酶水解豬皮膠原蛋白的最適條件：時間5 h、溫度30℃、pH3、酶與底物比4 000 U/g、底物濃度8%，此時DH4.47%，O2－·清除率48.49%；胰蛋白酶水解豬皮膠原蛋白的最適條件：時間5 h、溫度40℃、pH9、酶與底物比2 000 U/g、底物濃度10%，此時DH12.15%，O2－·清除率76.49%。

2）五種蛋白酶水解豬皮膠原蛋白的水解產物均具有抗氧化性，但不同蛋白酶水解后的產物的抗氧化活性強弱不同。用不同的酶水解同一種膠原蛋白，因為酶的作用位點不同，所得的水解產物的氨基酸組成不同，也影響其抗氧化性的發揮。不同的水解條件影響膠原蛋白的水解程度，所得的水解產物的分子質量以及氨基酸組成不同，從而影響它的抗氧化性［19］。水解產物的抗氧化活性與蛋白酶種類、水解條件的關系有待進一步深入研究。

3）不同蛋白酶在其最適水解條件下對豬皮膠原蛋白的水解度依次為：木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶＞中性蛋白酶＞菠蘿蛋白酶＞胃蛋白酶。不同蛋白酶水解后的產物對O2－·清除率依次為：胰蛋白酶水解產物＞中性蛋白酶水解產物＞胃蛋白酶水解產物＞菠蘿蛋白酶水解產物＞木瓜蛋白酶水解產物。這與王運改等［20］、姚東瑞等［21］的研究結果一致，水解物的水解度與抗氧化活性之間沒有顯著的相關性。

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Hydrolyzing Effect Comparative Studies of Five Proteases on Pigskin Collagen

XIAO Lan1，2，LI Cheng1，*，FU Gang1，YU Xia1，DU Xin1，LI Xi-ran1
（1.College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya'an 625014，Sichuan，China；2.Department of Food Science，Sichuan Tourism University，Chengdu 610100，Sichuan，China）

With fresh pigskin as material，five different proteases including neutral protease，bromelain，pepsin，papain，trypsin were used to hydrolyze collagen.Taking DH and scavenging rate of O2－·as index，the condition of the five proteases hydrolyzing pigskin collagen was optimized according to single factor and orthogonal test，and comparatively study the five proteases effect on pigskin collagen.It turned out that：hydrolysates of the five proteases were all anti-oxidative，and the scavenging rates of O2－·were as follows：trypsin＞neutral protease＞pepsin＞bromelain＞papain.

neutral protease；bromelain；pepsin；papain；trypsin；hydrolyzing degree；scavenging rate of O2－·

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.003

2014-02-27

四川省教育廳項目（12ZB102）

肖嵐（1981—），女（漢），講師，博士研究生，從事畜產品加工與質量安全方面研究。

李誠（1964—），男，教授，博導，研究方向：畜產品加工與質量安全。