紅笛鯛I(yíng)RAK-4基因cDNA全長(zhǎng)的克隆及組織表達(dá)分析

黃郁蔥，魯義善，簡(jiǎn)紀(jì)常，吳灶和

（1.中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所，廣東 廣州510301；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049 ；3.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 //4.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江524088；5.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東 廣州 510225）

紅笛鯛I(yíng)RAK-4基因cDNA全長(zhǎng)的克隆及組織表達(dá)分析

黃郁蔥1，2，3，4，魯義善3，4，簡(jiǎn)紀(jì)常3，4，吳灶和4，5

（1.中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所，廣東 廣州510301；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049 ；3.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 //4.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江524088；5.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東 廣州 510225）

白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶4（interleukin-1 receptor-associated kinase 4，IRAK-4）是一種參與機(jī)體先天性免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)過程中的關(guān)鍵分子。采用RT-PCR和cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE-PCR）的方法從紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）頭腎中克隆 IRAK-4基因的 cDNA 全序列（登錄號(hào)：KF279357）。該序列全長(zhǎng)2 015 bp，包含5′ 非編碼區(qū)（5′ UTR）205 bp，3′ 非編碼區(qū)（3′ UTR）421 bp，開放閱讀框（ORF）1 389 bp，編碼462 個(gè)氨基酸。根據(jù)推導(dǎo)的氨基酸序列預(yù)測(cè)其蛋白分子質(zhì)量為52.0 ku，理論等電點(diǎn)為5.19。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，紅笛鯛I(yíng)RKA-4基因氨基酸序列與其他物種的同源性為54.2%～85.7%。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，紅笛鯛與斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）聚為一支，兩者有較近的親緣關(guān)系。用熒光定量PCR 分析紅笛鯛基因的組織表達(dá)差異，紅笛鯛I(yíng)RKA-4 基因在各組織中均有不同程度的表達(dá)，其中在皮膚、肝臟和胃中表達(dá)量最高，其次是胸腺、鰓、心臟、腸、肌肉和脾臟，在頭腎、后腎和腦的表達(dá)量最低。

紅笛鯛；IRAK-4；基因克隆；組織表達(dá)

先天性免疫是機(jī)體抵抗病原入侵的第一道防線，它的啟動(dòng)主要依賴于模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）識(shí)別病原體病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）［1］。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）作為機(jī)體最重要的模式識(shí)別受體之一，通過啟動(dòng)不同信號(hào)途徑參與機(jī)體的先天性免疫與獲得性免疫調(diào)節(jié)，在宿主防御微生物感染中起重要作用［2-5］。白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶（interleukin-1 receptor-associated kinase，IRAK）是TLR信號(hào)通路中的重要接頭分子，在信號(hào)通路中發(fā)揮重要的樞紐作用。迄今為止，哺乳類的 IRAK家族共鑒定出 4個(gè)成員：IRAK-1、IRAK-2、IRAK-M 和IRAK-4。其中IRAK-1和IRAK-4 在信號(hào)通路中起正向調(diào)節(jié)作用，IRAK-2和 IRAK-M 則起負(fù)向調(diào)節(jié)作用［6-10］。該家族所有成員均有一個(gè)保守的N-端死亡結(jié)構(gòu)域（Death Domain，DD）、中央激酶區(qū)域（Kinase Domain，KD）和較長(zhǎng)的C端區(qū)域（不包括IRAK-4）。IRAK-4 是IRAK家族中最重要的一種激酶［10-11］，通過該激酶和接頭分子的作用，介導(dǎo)一系列胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終誘導(dǎo)包括前炎癥細(xì)胞因子等一系列基因的表達(dá)［7-12］。IRAK-4基因缺陷的小鼠 IL-1R/TLR 信號(hào)通路被嚴(yán)重阻斷，抑制了NF-κB 激活和炎癥因子的產(chǎn)生，不能有效抵抗細(xì)菌和病毒攻擊，表明IRAK-4在先天性免疫中起關(guān)鍵作用［13］。此外，IRAK-4的激酶失活可抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成［14］。

目前，斑馬魚（Danio rerio）［15］、松江鱸魚（Trachidermus fasciatus）［16］、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）［17］、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［18］、石斑魚（Epinephelus coioides）［19］等多種魚類的IRAK-4 基因相繼得到克隆鑒定。研究發(fā)現(xiàn)，不同魚類的IRAK-4組織分布不同，且在受病原細(xì)菌、寄生蟲及病毒刺激后表達(dá)量上調(diào)［15-19］，表明魚類IRAK-4 在魚體抵御病原侵染的免疫反應(yīng)中可能發(fā)揮著重要作用。紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）是我國(guó)南方沿海地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)魚類之一，然而近年來養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化，病害頻繁暴發(fā)，給其養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失［20］。本研究運(yùn)用RT-PCR 方法克隆到IRAK-4 cDNA 全序列，并分析其基因結(jié)構(gòu)特征和相應(yīng)的氨基酸序列及組織分布，為闡明該基因在抵御病原感染過程中的作用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

健康紅笛鯛（80～100g）購(gòu)自湛江某海水養(yǎng)殖場(chǎng)，大腸桿菌DH5α和哈氏弧菌（Vibrio harveyi）由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。RNAlater 購(gòu)自Ambion公司，Trizol購(gòu)自 Invitrogen 公司，TransStart Green qPCR SuperMix 試劑盒購(gòu)自全式金生物技術(shù)公司，Ex-taq、LA-taq、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit 等購(gòu)自TaKaRa 公司，Gel Extraction Kit 購(gòu)自O(shè)mega 公司。

1.2組織采樣

實(shí)驗(yàn)魚暫養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取健康紅笛鯛3 尾，分別取肝、頭腎、脾、腎臟、腦、心臟、鰓、皮膚、肌肉、腸和胃組織，立即投入 RNAlater 中，轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆茫占慕M織主要用于cDNA 克隆和組織分布分析。

1.3總RNA提取和cDNA一鏈合成

按Trizol說明書分別提取組織總RNA。用凝膠電泳檢測(cè) RNA完整性，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度，保證其D（260 nm）/D（280 nm）在1.8～2.0。所提取的各組織總RNA經(jīng)Dnase I消化后，按照M-MLV說明書合成cDNA第一鏈用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。另取頭腎的總RNA，按SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit 說明書分別合成用于3′ 與5′ RACE 擴(kuò)增的cDNA 模板。

1.4引物設(shè)計(jì)與中間片段擴(kuò)增

根據(jù)GenBank上已登錄的IRAK-4基因核苷酸序列（Gadus morhua，HM046453；Plecoglossus altivelis altivelis，AB469846）的保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物IRAK-4F與IRAK-4R（表1），擴(kuò)增紅笛鯛I(yíng)RAK-4 基因的部分序列。降落PCR反應(yīng)條件如下：94℃ 下預(yù)變性4min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 45s，5個(gè)循環(huán)；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 45s，5 個(gè)循環(huán)；94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 30s，30個(gè)循環(huán)；72℃下延伸5min，4℃條件下保存。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)10 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收后，與pMD-18T Vector連接轉(zhuǎn)化DH5α，陽(yáng)性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

表1　實(shí)驗(yàn)中所用的引物序列Table 1 Sequences of primers used for cloning and expression

1.5IRAK-4 基因3′ 與5′ 端擴(kuò)增

根據(jù)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增獲得的部分序列，設(shè)計(jì)IRAK-4 cDNA全長(zhǎng)的3′ RACE 和5′ RACE 引物（表1）。IRAK-4F1、IRAK-4R1分別與試劑盒自帶的UPM Mix引物進(jìn)行3′ 與5′ RACE第一輪降落PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94℃下預(yù)變性3min；94℃ 30s，68℃ 2min，5個(gè)循環(huán)；94℃ 30s，64℃30s，72℃ 2min，5個(gè)循環(huán)；94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 2min，25 個(gè)循環(huán)；72℃下延伸5min，4℃條件下保存。將第1輪PCR 產(chǎn)物稀釋20倍作為第2輪的模板，分別IRAK-4F2、IRAK-4R2與試劑盒引物NUP進(jìn)行第2輪降落PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃ 30s，62℃ 45s，72℃ 2min，30個(gè)循環(huán)；于72℃下延伸5min，4℃條件下保存。余下步驟同1.2.3。

1.6生物學(xué)信息分析

擴(kuò)增獲得的序列使用DNAMAN6.0進(jìn)行序列拼接，利用NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行序列同源性比對(duì)和相似性分析，采用ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）和ExPASy Proteomics Server（http://ca.expasy.org）推導(dǎo)氨基酸序列、確定開放閱讀框（ORF）、計(jì)算分子質(zhì)量mM和預(yù)測(cè)理論等電點(diǎn)pI等，通過在線分析軟件 SignalP 4.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）預(yù)測(cè)信號(hào)肽序列，采用 TMHMM Server 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域，用NetGlyc1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc）和NetPhos2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析蛋白質(zhì)N-糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)，用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）和InterProScan Sequence Search（http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search）分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)采用PSORT II Prediction（http://psort.hgc.jp/form2.html）。采用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。采用SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?func=modelling_simple1）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，使用ClastalX 2.0 及MEGA 6.0 軟件，以鄰位相連法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.7紅笛鯛I(yíng)RAK-4基因的組織表達(dá)分析

利用引物reIRAK-4F、reIRAK-4R與內(nèi)參基因β-actin引物β-actinF、β-actinR，通過熒光定量PCR分析紅笛鯛 IRAK-4基因在各組織中的表達(dá)。將合成的cDNA 第一鏈用無菌ddH2O適當(dāng)稀釋后作為熒光定量PCR 的模板，以紅笛鯛β-actin為內(nèi)參基因，利用ABI7300 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀分析紅笛鯛I(yíng)RAK-4基因的表達(dá)量，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 3min，94℃變性20s，60℃退火20s，72℃延伸20s，40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后以各組織中最低的mRNA 表達(dá)量為基準(zhǔn)，通過2ˉΔΔCT方法計(jì)算紅笛鯛I(yíng)RAK-4 基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量。

2　結(jié) 果

2.1IRAK-4基因的全長(zhǎng)cDNA序列分析

紅笛鯛I(yíng)RAK-4基因cDNA序列全長(zhǎng)2 015 bp（GenBank登錄號(hào)KF279357），包含5′ 非翻譯區(qū)（5′UTR）205 bp，3′ 非翻譯區(qū)（3′ UTR）421 bp，開放閱讀框1 393 bp，編碼462個(gè)氨基酸（圖1）。3′ UTR含一加尾信號(hào)（AATAAA）和不穩(wěn)定基序（ATTTA）。

圖1　cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1　cDNA sequence and deduced amino acid sequence

2.2IRAK-4氨基酸組成和蛋白結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)推導(dǎo)的氨基酸序列，預(yù)測(cè)其理論分子質(zhì)量為52.0 ku，等電點(diǎn)為5.19。該基因氨基酸序列含有一個(gè)典型的IRAK家族所有的死亡結(jié)構(gòu)域（1～104 aa）、絲氨基酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域（183～462 aa）及蛋白激酶家族的特征基序，如蛋白激酶 ATP 結(jié)合域信號(hào)（protein kinase ATP-binding region signature，LGEGGFGTVYKGLLNDKPVAVKK）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)信號(hào)（Serine/Threonineprotein kinases active-site signature，HVHRDVKSANILLD）（圖 1）。利用 SignalP 4.0 Server 程序?qū)t笛鯛 IRAK-4 氨基酸序列進(jìn)行 N端信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，未發(fā)現(xiàn)有信號(hào)肽序列。用TMHMM Server v.2.0 程序預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該蛋白不存在跨膜區(qū)。用NetNGlyc 1.0預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其含有4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。用NetPhos 2.0軟件預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)共有17個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，10個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)酪蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。

通過SOPMA軟件進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示，在 IRAK-4蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋占37.88%，β-轉(zhuǎn)角占7.58%，無規(guī)卷曲占41.77%，延伸鏈占12.77%（圖2）。將紅笛鯛DD和S_TKc氨基酸序列提交至 SWISS-MODEL 程序，自動(dòng)搜索同源蛋白作模板，得到IRKA-4三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。結(jié)果顯示，紅笛鯛DD空間結(jié)構(gòu)與小鼠的DD高度相似（圖3），包括6個(gè)α螺旋；紅笛鯛S_TKc 空間結(jié)構(gòu)與小鼠的S_TKc高度相似（圖4）。

圖2　SOPMA 軟件對(duì)IRAK4 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果Fig.2　Secondary structure of IRAK-4 protein analyzed by SOPMA

圖3　預(yù)測(cè)的紅笛鯛I(yíng)RAK-4 DD（a）與小鼠的IRAK-4 DD（b）空間結(jié)構(gòu)的比較Fig.3　Comparison of the predicted 3D structure between sanpper IRAK-4（1 - 106 aa）and solution structure of the death domain from mouse IRAK-4（PDB ID:1wh4，chain A）

圖4　預(yù)測(cè)的紅笛鯛I(yíng)RAK-4 的S_TKc（c）與人IRAK-4 的S_TKc（d）空間結(jié)構(gòu)的比較Fig.4　Comparison of the predicted 3D structure of IRAK-4（183-462 aa）and crystal structure of the S_TKc　from human IRAK-4（PDB ID:2NRU，chain B）

2.3氨基酸同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用Clustal X2.0軟件，對(duì)紅笛鯛I(yíng)RAK-4和NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)已登錄的其他物種的IRAK-4 進(jìn)行氨基酸序列同源性比對(duì)分析，結(jié)果如圖5所示，紅笛鯛與其他物種的IRAK-4具有不同程度的同源性，其中紅笛鯛I(yíng)RAK-4與斜帶石斑魚（E.coioides）、松江鱸魚（T.fasciatus）和半滑舌鰨（C.semilaevis）的IRAK-4同源性較高，同源率分別為高達(dá)85.7%、82.7%和72.2%，與爪蟾（Xenopus tropicalis）的同源性最低，為52.1%。

續(xù)圖5 (Continued)

利用MEGA 6.0 的Neighbor-joining 法構(gòu)建的IRAK-4 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖6。圖6顯示，紅笛鯛首先與鱸形目的石斑魚（E.coioides）聚在一起，然后再與其他魚類聚成一個(gè)大的分支，兩棲類、鳥類和哺乳類聚在一起，與魚類形成兩個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支。

2.4IRKA-4 組織表達(dá)分析

IRKA-4 在被檢測(cè)的鰓、腦、肌肉、皮膚、腸、頭腎、脾臟、肝臟、心臟等組織中均有不同程度的表達(dá)，在皮膚、肝臟和胃中表達(dá)量最高，其次為胸腺、鰓、心臟、腸和脾臟，在腦中的表達(dá)量最低（圖7）。

圖6　基于NJ 法構(gòu)建IRAK-4氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6　Phylogenetic tree of snapper and other vertebrate IRAK-4s constructed with the Neighour-Joining method

圖7　紅笛鯛I(yíng)RAK-4基因的組織表達(dá)Fig.7　Tissue distribution of IRAK-4 in healthy snapper

3　討 論

本研究通過同源克隆和RACE PCR技術(shù)獲得紅笛鯛I(yíng)RAK-4基因，該基因cDNA全長(zhǎng)2 015 bp，開放閱讀框1 393 bp，編碼462個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為52.0 ku，等電點(diǎn)為5.19。與已發(fā)現(xiàn)的其他魚類和哺乳動(dòng)物的IRAK-4類似，紅笛鯛I(yíng)RAK-4基因編碼的氨基酸序列具有保守的死亡結(jié)構(gòu)域和激酶結(jié)構(gòu)域。

在TLR/IL-1R信號(hào)通路中，IRAK-4通過其死亡結(jié)構(gòu)域與接頭分子MyD88、IRAK-2的死亡結(jié)構(gòu)域相互作用，組裝成一個(gè)稱為“myddosome”的緊密連接復(fù)合體［21］，同時(shí)IRAK-1被募集至受體復(fù)合物，并與IRAK-4緊密接觸，從而使IRAK-1的KD區(qū)磷酸化并激活 IRAK-1，引發(fā)后續(xù)的信號(hào)傳導(dǎo)。在哺乳動(dòng)物IRAK-4死亡結(jié)構(gòu)域中，參與復(fù)合體分子間相互連接的關(guān)鍵氨基酸殘基（R12、V16、R20、F25、Q50、F51、R54、E69、T76、N78、A95）高度保守。在紅笛鯛和其他硬骨魚中 V16則變異較大，分別被L/H/F/Y所取代，被看作是TLR信號(hào)通路分子共同進(jìn)化的一個(gè)證據(jù)，因?yàn)镸yD88中的連接堿基同樣發(fā)生了變異［18］。此外，硬骨魚中與IRAK-2相連接的F25和F51同樣發(fā)生較大的變異，在紅笛鯛中F51被N取代，由于目前在魚類中尚未發(fā)現(xiàn)IRAK-2，故這兩個(gè)堿基變異是否對(duì)IRAK-4與IRAK-2間的連接產(chǎn)生影響尚需要進(jìn)一步研究。建模結(jié)果顯示，紅笛鯛I(yíng)RAK-4的死亡結(jié)構(gòu)域含有6個(gè)α螺旋，與小鼠的死亡結(jié)構(gòu)域高度相似，同時(shí)還含有一個(gè)保守的關(guān)鍵堿基W74，該堿基在小鼠中位于三維結(jié)構(gòu)的疏水性核心，介導(dǎo)α螺旋的空間連接［22］。根據(jù)死亡結(jié)構(gòu)域空間結(jié)構(gòu)的高度相似性和關(guān)鍵氨基酸殘基的保守性，推測(cè)魚類IRAK-4與哺乳動(dòng)物IRAK-4的結(jié)構(gòu)和功能相似。

激酶結(jié)構(gòu)域是IRKA-4的另一個(gè)重要功能結(jié)構(gòu)域，哺乳動(dòng)物IRAK-4的激酶結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)對(duì)蛋白激酶活性起關(guān)鍵作用的激活環(huán)，IRAK-4激酶活性主要依賴激活環(huán)上 3個(gè)特定的氨基酸（T342、T345和S346）自磷酸化［14］，由該3個(gè)氨基酸的定點(diǎn)突變結(jié)果，發(fā)現(xiàn)催化活性分別降至57%、66%和50%［23］。紅笛鯛的IRAK-4激酶結(jié)構(gòu)域中前面的兩個(gè)蘇氨酸酸殘基（T342、T345）與哺乳動(dòng)物相同，但第3個(gè)絲氨酸殘基被谷氨酸取代，導(dǎo)致該自磷酸化位點(diǎn)的缺少，該位點(diǎn)的缺失是否會(huì)導(dǎo)致其激酶活性下降有待進(jìn)一步的研究。同時(shí)紅笛鯛蛋白激酶ATP 結(jié)合域信號(hào)含有兩個(gè)重要的賴氨酸（KK213），這兩個(gè)賴氨酸在其他魚類和哺乳動(dòng)物中高度保守，突變可導(dǎo)致人IRAK-4激酶活性喪失［24］。在絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)信號(hào)序列中保守的天冬氨酸殘基（D340）在紅笛鯛中同樣存在，對(duì)于其保持激酶活性至關(guān)重要［25］。此外，在紅笛鯛 IRAK-4還含有一個(gè)被稱為“gatekeeper”的酪氨酸，它是IRAK家族4個(gè)成員所特有的氨基酸，目前已被證實(shí)在激酶選擇性結(jié)合各種小分子和 ATP 競(jìng)爭(zhēng)抑制劑方面發(fā)揮重要作用［25］。

在哺乳動(dòng)物中，IRAK-4廣泛表達(dá)于各種組織中，其中在腎臟和肝臟表達(dá)量最高［24］。目前的研究表明，魚類 IRAK-4在各個(gè)組織均有不同程度的表達(dá)，斑馬魚和斜帶石斑魚的 IRAK-4在頭腎和脾臟中表達(dá)量最高［15，19］，表明其在免疫系統(tǒng)中具有重要作用。然而本研究顯示，IRAK-4在紅笛鯛的皮膚和肝臟中表達(dá)量最高，與松江鱸魚的研究結(jié)果相似［17］。皮膚是魚類防御病原侵染的第一道防線，IRAK-4在皮膚中的高量表達(dá)預(yù)示著其可能在抵御外源病原入侵中發(fā)揮重要作用。魚類 IRAK-4在細(xì)菌、病毒寄生蟲刺激后表達(dá)量上調(diào)或下調(diào)［15，17-19］，表明魚類 IRAK-4對(duì)不同刺激物具有不同的免疫應(yīng)答機(jī)制。同時(shí)魚類 IRAK-4轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其功能與哺乳動(dòng)物不同，顯著削弱NF-κB活性，其確切的作用機(jī)制尚不清楚。因此，今后通過構(gòu)建真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染魚類細(xì)胞探索其對(duì)魚類細(xì)胞TLR/IL-1R信號(hào)通路的影響，分析其調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能及抗病原微生物免疫反應(yīng)中的功能和作用機(jī)制，將為我們進(jìn)一步了解 IRAK-4在魚類免疫系統(tǒng)中的作用提供新的理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：劉慶穎）

Full-length cDNA Cloning and Tissue Expression Analysis of IRAK-4 Gene from Humphead Snapper (Lutjanus sanguineus)

HUANG Yu-cong1，2，3，4，LU Yi-shan3，4，JIAN Ji-chang3，4，WU Zao-he4，5
（1.South China Sea Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510301，China；2.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China； 3.Fisheries College，Guangdong Ocean University //4.Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088，China； 5.Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，China）

Interleukin-1 receptor-associated kinase 4（IRAK-4）is a key molecular which participates in the innate immune and adaptive immune processes.In this paper，full length cDNA sequence of IRAK-4 gene was amplified by RT-PCR and RACE PCR from head kidney of humphead snapper，Lutjanus sanguineus（GenBank accession number:KF279357）.The total cDNA sequence of humphead snapper IRAK-4 was 2 015 bp，including 3' UTR of 421 bp，5' UTR of 205 bp，an open reading frame（ORF）of 1 389 bp encoding 462 amino acids with Molecule Mass of 52.0 ku and pI of 5.19.The deduced amino acid sequence of humphead snapper IRAK-4 shared 54.2% - 85.7% identities with other species IRAK-4.Phylogenetic analysis showed that humphead snapper was clustered closely with orange-spotted grouper.In addition，the mRNA expression levels in different tissues were analyzed byreal time quantitative PCR.The result showed that humphead snapper IRAK-4 expressed in all examined tissues with highest levels in skin，liver and stomach，moderate levels in thymus，gill，heart，intestine，muscle and spleen，and lowest levels in head kidney，kidney and brain.

Lutjanus sanguineus； IRAK-4； gene cloning； tissue expression

Q78；Q959.483

A

1673-9159（2015）01-0018-10

2014-12-30

十二五國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2012BAD17B03），廣東省海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范專項(xiàng)（GD2012-B01-004），國(guó)家自然基金（41240041）

黃郁蔥（1978-），男，講師，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物病害防治。E-mail :hyczjou@163.com

吳灶和，教授，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物免疫學(xué)及病害控制。E-mail :wuzaohe@163.com