睪丸扭轉復位后生精功能損傷的分子機制研究

歐瓔瓔　吳遠鵬　韋思明　楊淑嬌

睪丸扭轉復位后生精功能損傷的分子機制研究

歐瓔瓔吳遠鵬韋思明★楊淑嬌

目的 探討睪丸扭轉復位后過量產生的活性氧是否通過調控TATA結合蛋白相關因子2（TRF2）的表達導致生精功能損傷。方法 60只成年雄性SD大鼠分為3組，各20只。對照組左側睪丸假手術。扭轉復位組接受左側睪丸扭轉，1h后復位。清除活性氧組承受與扭轉復位組相同的手術，但在復位時給予活性氧清除劑超氧化物歧化酶和過氧化氫酶靜脈注射。復位后4h或3個月切除睪丸術，其標本測定丙二醛水平（活性氧標記），TRF2表達和生精功能。結果 單側睪丸扭轉復位明顯增加同側睪丸（即左側扭轉復位睪丸）丙二醛水平，降低TRF2表達和生精功能。相反，靜脈注射活性氧清除劑超氧化物歧化酶和過氧化氫酶顯著降低同側睪丸的丙二醛水平，提高TRF2表達和生精功能。結論 睪丸扭轉復位后，過量產生的活性氧通過下調TRF2表達導致生精功能損傷。

睪丸扭轉復位 活性氧 TATA結合蛋白相關因子2 生精功能

睪丸扭轉是指睪丸繞精索旋轉，導致睪丸缺血。睪丸扭轉復位是一個缺血再灌注過程。睪丸缺血再灌注導致生精功能損傷［1］，而睪丸缺血再灌注損傷的分子機制仍然不明。TATA結合蛋白相關因子2（TRF2）調控生精細胞特異基因的轉錄，對精子發生必不可少［2］。本文探討TRF2在睪丸缺血再灌注損傷中的作用。

1　材料與方法

1.1材料 250～300g成年雄性SD大鼠購自上海實驗動物中心。超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和β-肌動蛋白抗體（β-actin）購自Sigma公司。丙二醛試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。TRF2抗體由Santa Cruz公司提供。

1.2方法 60只成年雄性SD大鼠被分為3組：對照組、扭轉復位組和清除活性氧組，各20只。氯胺酮（50mg/ kg）腹腔麻醉后，在無菌條件下施行外科手術。通過左側髂腹股溝切口顯露左側睪丸。對照組：將 11/0縫線穿過睪丸白膜，然后放睪丸入陰囊，關閉切口。扭轉復位組：將左側睪丸逆時針旋轉720°，用11/0縫線固定睪丸至陰囊，保持睪丸扭轉狀態。1h后拆除縫線，將睪丸順時針旋轉720°復位。清除活性氧組：大鼠承受與扭轉復位組相同的手術，但在復位時，從尾靜脈注射活性氧清除劑超氧化物歧化酶和過氧化氫酶（5mg/kg）。復位后4h，每組一半的大鼠被處死，切除睪丸，其標本測定丙二醛水平。復位后3個月，處死剩余的大鼠，切除睪丸，測定睪丸TRF2表達和生精功能。

1.3丙二醛水平測定 用硫代巴比妥酸法測量睪丸的丙二醛水平，操作按試劑盒說明書進行。

1.4TRF2蛋白表達測定 用Western blot法測量睪丸的TRF2蛋白表達水平。TRF2與內參照β-actin的條帶密度比值表示TRF2蛋白表達水平。

1.5睪丸生精功能評估 睪丸切下后稱重，然后做成石蠟切片、蘇木素-伊紅染色，在顯微鏡下觀察睪丸組織結構。通過測量睪丸重量、曲細精管直徑、生精細胞層數及Johnsen評分來評定睪丸生精功能。

1.6統計學方法 采用GraphPad Prism 4.0軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析和q檢驗，組內比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1睪丸丙二醛水平 與對照組比較，扭轉復位組同側睪丸（即左側扭轉復位睪丸）的丙二醛水平明顯增加（P＜0.05）；與扭轉復位組同側睪丸比較，清除活性氧組同側睪丸的丙二醛水平顯著降低（P＜0.05）；3組對側睪丸（即右側睪丸）的丙二醛水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2睪丸TRF2蛋白表達 與對照組比較，扭轉復位組同側睪丸的TRF2表達明顯降低（P＜0.05）；與扭轉復位組同側睪丸比較，清除活性氧組同側睪丸的TRF2表達顯著升高（P＜0.05）；3組對側睪丸的TRF2表達差異無統計學意義（P＞0.05）；見圖1。

圖1　三組睪丸的TRF2蛋白表達。（A）TRF2表達的代表性結果。β-actin作為內參照，1L和1R表示對照組左側（即同側）和右側（即對側）睪丸，2L和2R表示扭轉復位組同側和對側睪丸，3L和3R表示清除活性氧組同側和對側睪丸。（B）TRF2表達的定量分析。有影線的長條表示同側睪丸，空白長條表示對側睪丸。與對照組相比★P＜0.05；與同組對側睪丸相比，#P＜0.05；與扭轉復位組同側睪丸相比，§P＜0.05。

2.3睪丸生精功能 與對照組比較，扭轉復位組同側睪丸的重量、曲細精管直徑、生精細胞層數及Johnsen評分顯著降低（P＜0.05）；與扭轉復位組同側睪丸比較，清除活性氧組同側睪丸的上述4個指標明顯升高（P＜0.05）；3組對側睪丸的這些指標差異無統計學意義（P＞0.05）；見圖2和3。

圖2　三組睪丸的（A）重量，（B）曲細精管直徑，（C）生精細胞層數和（D）Johnsen評分。影線長條表示同側睪丸，空白長條表示對側睪丸。與對照組比較，★P＜0.05；與同組對側睪丸比較，#P＜0.05；與扭轉復位組同側睪丸比較，§P＜0.05

圖3　三組睪丸的組織學所見。（A）對照組雙側睪丸，扭轉復位組與清除活性氧組對側睪丸均顯示正常的曲細精管直徑﹑生精細胞層數和生精細胞分化，可見較多成熟的精子（箭頭所指處）。生精上皮在管腔中央留下一空腔。（B） 扭轉復位組同側睪丸顯示曲細精管直徑縮小，生精細胞層數減少。生精細胞僅發育到圓形精子細胞階段（箭頭所指處），未見成熟的精子。（C）清除活性氧組同側睪丸呈現幾乎正常的睪丸組織特征，有較多成熟精子（箭頭所指處）。但管腔中央可見脫落的生精上皮，容易堵塞管腔。圖片均蘇木素-伊紅染色，放大200倍

3　討論

本資料中，大鼠經歷1h的睪丸扭轉，復位后仍然存活，但復位后3個月，生精功能嚴重破壞。TRF2是一個轉錄因子，調控生精細胞特異基因的轉錄，對生精細胞發育至關重要［2］。缺乏TRF2基因的成年雄性小鼠睪丸重量減輕50%，曲細精管直徑縮小20%～30%，管中僅有精原細胞、精母細胞和圓形精子細胞，缺乏成熟的精子［2］。本資料結果顯示：單側睪丸扭轉復位引起同側睪丸TRF2表達明顯降低，生精功能嚴重損傷，表現為睪丸重量減輕，曲細精管直徑縮小，生精細胞發育停止在圓形精子細胞階段，未見成熟的精子。因TRF2表達對精子發生必不可少，單側睪丸扭轉復位后同側睪丸TRF2表達降低可能是生精功能損傷的原因之一。

睪丸扭轉復位后的損傷是缺血再灌注損傷。睪丸缺血再灌注導致活性氧（如過氧化氫、羥自由基、超氧陰離子等）過量產生［1］。已有研究認為［1］：注入活性氧清除劑超氧化物歧化酶和過氧化氫酶可以減輕睪丸的缺血再灌注損傷，表明活性氧是引起睪丸損傷的原因。但活性氧通過何種分子機制損傷睪丸生精功能仍不明確。活性氧是高反應氧化劑，很難直接測定。丙二醛是活性氧的穩定末端產物，被認為是活性氧的可靠標志。本資料中，扭轉復位組同側睪丸的丙二醛水平明顯升高，表明睪丸扭轉復位后活性氧過量產生。活性氧可以通過調控基因表達影響細胞分化和凋亡［3］。

單側睪丸扭轉復位是否對對側睪丸產生不利影響，目前存在爭議。研究發現單側睪丸扭轉復位通過神經反射等機制導致對側睪丸損傷［4］，但另外一些研究未發現同樣結果［5］。本資料，單側睪丸扭轉復位引起同側睪丸的丙二醛水平、TRF2表達和生精功能發生明顯變化，但對側睪丸無顯著改變。表明單側睪丸扭轉復位未引起對側睪丸損傷。睪丸扭轉復位后過量產生的活性氧通過下調TRF2表達導致生精功能損傷。其可能是睪丸扭轉復位后生精功能損傷的機制之一。本資料結果也鼓勵使用活性氧清除劑減輕睪丸損傷。

1 Lysiak JJ， Nguyen QA， Turner TT. Peptide and nonpeptide reactive oxygen scavengers provide partial rescue of the testis after torsion. J Androl， 2002，23（3）：400～409.

2 Zhang D， Penttila TL， Morris PL， et al. Spermiogenesis deficiency in mice lacking the Trf2 gene. Science， 2001， 292（5519）：1153～1155.

3 Tien Kuo M， Savaraj N. Roles of reactive oxygen species in hepatocarcinogenesis and drug resistance gene expression in liver cancers. Mol Carcinog，2006，45（9）：701～709.

4 Karaguzel E， Kadihasanoglu M， Kutlu O. Mechanisms of testicular torsion and potential protective agents. Nat Rev Urol， 2014， 11（7）：391～399.

5 ?ayan S， Saylam B， Tiftik N， et al. Rho-kinase levels in testicular ischemiareperfusion injury and effects of its inhibitor， Y-27632， on oxidative stress，spermatogenesis， and apoptosis. Urology， 2014， 83（3）： 675，e13～18

Objective This study investigated whether overproduction of ROS after testicular torsion-detorsion injures spermatogenesis by regulating TRF2 expression. Methods Sixty adult male Sprague-Dawley rats were divided into three groups of 20 rats each. Control group received a sham operation of left testis. Torsion-detorsion group underwent 1 hour of left testicular torsion. Scavenging ROS group received same operation as torsion-detorsion group，but superoxide dismutase and catalase，two ROS scavengers，were given intravenously at detorsion. Testes were harvested 4 hours or 3 months after detorsion to measure malondialdehyde level（a marker of ROS），TRF2 expression and spermatogenesis. Results Unilateral testicular torsion-detorsion signifi cantly increased malondialdehyde level，and reduced TRF2 expression and spermatogenesis in ipsilateral testes，suggesting that overgeneration of ROS after testicular torsion-detorsion might down-regulate TRF2 expression，leading to spermatogenic damage. In contrast，administration of superoxide dismutase and catalase significantly decreased malondialdehyde level，and increased TRF2 expression and spermatogenesis in ipsilateral testes. These results supported the above hypothesis. Conclusion Overproduction of ROS after testicular torsion-detorsion can damage spermatogenesis by down-regulation of TRF2 expression.

Testicular torsion-detorsion Reactive oxygen species TATA box-binding protein-related factor 2 Spermatogenesis

浙江醫學高等專科學校博士科研啟動基金項目（2008B05）

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