大腸癌組織中Six1和CyclinD1的表達及其臨床意義

朱鵬武　吳春松　鄭海紅

大腸癌組織中Six1和CyclinD1的表達及其臨床意義

朱鵬武吳春松鄭海紅

目的 探討胚胎發育調節因子（Six1）和細胞周期蛋白D1（CyclinD1）在大腸癌組織中的表達及其臨床意義，分析Six1和CyclinD1表達的相關性。方法 采用免疫組化En Vision法檢測65例大腸癌組織和20例癌旁正常組織中Six1和CyclinD1的表達。結果 大腸癌組織中Six1和CyclinD1的陽性表達率分別為 70.77% 和60.00%，均明顯高于癌旁正常組織的15.00% 和0%，組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。Six1和CyclinD1表達與大腸癌患者臨床分期﹑浸潤深度及淋巴結是否轉移有關（P＜0.05），而與患者年齡﹑性別﹑腫瘤大小及分化程度無關（P＞0.05）。大腸癌組織中Six1和CyclinD1的表達呈正相關（P＜0.05）。結論 Six1和CyclinD1過表達可能與大腸癌的發生﹑發展密切相關，聯合檢測Six1和CyclinD1表達可用于評估大腸癌的浸潤﹑轉移能力和預后。

大腸癌 Six1 CyclinD1 浸潤 轉移

大腸癌是全球腫瘤相關死亡的第2位常見的原因，約50%大腸癌患者死于遠處轉移相關的并發癥［1］。Six1蛋白參與染色質重構和基因的轉錄，在細胞凋亡過程中起著重要的作用。Six1過表達與肝癌［2］、胃癌［3］和宮頸癌［4］等多種腫瘤的不良預后有關。細胞周期蛋白D1（CyclinD1）是一個重要的細胞周期調節蛋白，在細胞周期G1/S關鍵點起著正向調控作用。研究［5］認為，腦膠質瘤中CyclinD1表達升高，提示CyclinD1可能在膠質瘤的發生過程中發揮重要作用。本文旨在探討Six1和CyclinD1聯合表達的臨床意義。

1　臨床資料

1.1一般資料 選取2009年10月至2013年12月臨海市第一人民醫院和臺州醫院手術切除大腸癌標本65例，標本均經病理檢查明確診斷，患者術前均未接受放療、化療、生物治療或免疫治療。其中男35例，女30例；年齡32～80歲，平均（60.35±12.87）歲。組織學分級：高中分化37例、低分化28例。參照2010年美國癌癥聯合委員會（AJCC）/國際抗癌聯盟（UICC）修訂的TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期31例、Ⅲ～Ⅳ期34例。淋巴結轉移情況：有轉移20例、無轉移45例。所有患者均有完整的臨床病理資料。選擇同期20例癌旁組織為對照組，癌旁組織距腫瘤原發灶＞5cm，病理證實為正常大腸組織。

1.2主要試劑 兔抗人Six1單克隆抗體購自美國Sigma公司，兔抗人CyclinD1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，即用型羊抗兔免疫組化En VisionTM檢測試劑盒和DAB顯色劑均購自Dako公司。

1.3檢測方法 所有組織標本離體后迅速用10%中性甲醛溶液固定，常規脫水、石蠟包埋保存。采用En Vision二步法進行免疫組化染色，高壓鍋進行抗原修復，正常山羊血清封閉30min，一抗4℃冰箱過夜，二抗孵育30min，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。用已知陽性片作陽性對照，以PBS液代替一抗作陰性對照。

1.4結果判定 Six1和CyclinD1染色陽性信號為出現棕黃色顆粒，均定位于細胞核。選取＞5個高倍視野（×400），每個視野計數≥200個細胞中的陽性細胞數，陽性細胞數≥10%為陽性，＜10%為陰性。

1.5統計學方法 采用SPSS13.0軟件。Six1和CyclinD1在大腸癌中的表達及與臨床病理特征的關系采用χ2檢驗，兩者表達的相關性采用Spearman等級相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1大腸癌和癌旁正常組織中Six1和CyclinD1的表達 Six1和CyclinD1均以細胞核出現棕黃色顆粒為陽性（見圖1和圖2）。大腸癌組織中Six1和CyclinD1的陽性表達率分別為70.77% 和60.00 %，均明顯高于癌旁正常組織的15.00 % 和0 %，組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

圖1　Six1在大腸癌組織中陽性表達（En Vision×400）

圖2　CyclinD1在大腸癌組織中陽性表達（En Vision×400）

表1　Six1和CyclinD1在大腸癌和癌旁正常組織中的表達［n（%）］

2.2Six1和CyclinD1表達與大腸癌臨床病理特征的關系 Six1和CyclinD1蛋白表達在大腸癌患者臨床分期、浸潤深度及淋巴結是否轉移差異有統計學意義（P＜0.05），而與患者年齡、性別、腫瘤大小及分化程度無關（P＞0.05）。見表2。

表2　Six1和CyclinD1表達與大腸癌臨床病理特征的關系［n（%）］

2.3大腸癌組織中Six1和CyclinD1表達的相關性 65例大腸癌組織中，Six1和CyclinD1表達共陽性36例，陰性16例，Six1和CyclinD1蛋白表達呈正相關（P＜0.05）。見表3。

表3　Six1和CyclinD1在大腸癌組織中表達的相關性（n）

3　討論

Six1是轉錄因子Six同源結構域家族成員之一，是一種進化上高度保守的轉錄因子［6］。早期的研究顯示，Six1是胚胎發育的關鍵調節因子，可通過與Eya家族蛋白相互作用激活基因轉錄，參與神經、肌肉和腎的發生［7］。近來研究［8，9］認為，Six1在多種腫瘤細胞中呈現高表達，在惡性腫瘤增殖、轉移和存活中起著重要作用。Li等［10］采用慢病毒載體介導的短發夾RNA（shRNA）基因敲除的方法來抑制大腸癌細胞Six1表達。研究表明shRNA能有效地降低其表達在大腸癌細胞中Six1 mRNA和蛋白水平。體外功能實驗表明，下調Six1顯著抑制細胞增殖，抑制結、直腸癌細胞遷移和侵襲。此外，腫瘤異種移植模型表明，下調Six1顯著抑制體內的大腸癌生長。CyclinD1屬于Cyclins家族成員之一。CyclinD1定位于11q13，包含5個外顯子和4個內含子，編碼295個氨基酸，分子量為34KD。CyclinD1是細胞周期起始和進展的一個重要傳感器和激活器，CyclinD1過表達可誘導細胞周期從G1期進入S期引起細胞周期調控異常，導致細胞無限增殖。在一些惡性腫瘤中CyclinD1表達升高被認為與腫瘤的進展和系統治療反應有關［11］。

本資料結果顯示，大腸癌組織中Six1和CyclinD1陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，差異有統計學意義。提示Six1和CyclinD1過表達可能參與大腸黏膜上綜上所述，大腸癌組織中Six1和CyclinD1呈現過表達，其表達可能與大腸癌的發生、發展密切相關，聯合檢測Six1和CyclinD1表達情況可用于評估大腸癌的局部浸潤、遠處轉移能力和預后。

皮惡性轉化。進一步研究結果分析，Six1和CyclinD1蛋白表達在大腸癌患者臨床分期、浸潤深度及淋巴結是否轉移間的差異有統計學意義（P＜0.05），而與患者年齡、性別、腫瘤大小及分化程度無關（P＞0.05）。表明聯合檢測Six1和CyclinD1蛋白表達情況可用于評估大腸癌的局部浸潤、遠處轉移能力和預后。Spearman等級相關分析結果顯示，大腸癌組織中Six1和CyclinD1表達呈正相關。提示Six1表達升高，可能通過調控CyclinD1表達上調，進而調節細胞周期異常，導致細胞增殖異常。與Li等［12］研究認為Six1通過上調CyclinD1促進細胞周期進展和細胞增殖的結果一致。

1 de Krijger I， Mekenkamp LJ， Punt CJ，et al. MicroRNAs in colorectal cancer metastasis. J Pathol，2011，224（4）：438～447.

2 Kong J， Zhou X， Liu S ，et al. Overexpression of sineoculis homeobox homolog 1 predicts poor prognosis of hepatocellular carcinoma. Int J Clin Exp Pathol， 2014 ，7（6）：3018～3027.

3 Liu D， Zhang XX， Xi BX， et al. Sine oculis homeobox homolog 1 promotes DNA replication and cell proliferation in cervical cancer. Int J Oncol， 2014 ，45（3）：1232～1240.

4 Lv H， Cui A， Sun F，et al. Sineoculis homeobox homolog 1 protein as an independent biomarker for gastric adenocarcinoma. Exp Mol Pathol，2014 ，97（1）：74～80.

5 Qu DW， Xu HS， Han XJ， et al. Expression of cyclinD1 and Ki-67 proteins in gliomas and its clinical significance. Eur Rev Med Pharmacol Sci， 2014，18（4）：516～519.

6 Wu W， Ren Z， LiuH，Wang L， HuangR， Chen J， et al. Core promoter analysis of porcine Six1 gene and its regulation of the promoter activity by CpG methylation. Gene. 2013；529（2）：238～244.

7 Farabaugh SM， Micalizzi DS， Jedlicka P， et al. Eya2 is required to mediate the pro-metastatic functions of Six1 via the induction of TGF-beta signaling， epithelial-mesenchymal transition，and cancer stem cell properties. Oncogene. 2012；31（5）：552～562.

8 Tan J， Zhang C， Qian J. Expression and significance of Six1 and Ezrin in cervical cancer tissue. Tumour Biol， 2011，32（6）：1241～1247.

9 Qamar L， Deitsch E， Patrick AN， et al. Specificity and prognostic Validation of a polyclonal antibody to detect Six1 homeoprotein in ovarian cancer. Gynecol， Oncol， 125（2）：451～457.

10 Li Z， Tian T， Hu X， et al. Targeting Six1 by lentivirus-mediated RNA interference inhibits colorectal cancer cell growth and invasion. Int J Clin Exp Pathol， 2014，7（2）：631～639.

11 Peurala E， Koivunen P， Haapasaari KM， et al. The prognositic significance and value of cyclinD1， CDK4 and p16 in human breast cancer. Breast Cancer Res， 2013，15（1）：R5.

12 Li Z， Tian T， Lv F， et al. Six1 Promotes Proliferation of Pancreatic Cancer Cells via Upregulation of Cyclin D1 Expression. PLoS One，2013，8（3）：e59203.

Objiective To study the expression of Six1 and CyclinD1 in colorectal cancer and its clinical signifi cance，analyzing the relationship between expression of Six1 and CyclinD1 protein. Methods The expressions of Six1 and CyclinD1 in 65 cases of colorectal cancer and 20 cases of corresponding para-carcinoma colorectal mucosa tissues were deteted by immunohitochemical En Vision method. Results The positive rate of Six1 and CyclinD1 protein in colorectal cancer tissues was 70.77% and 60.00% respectively，compared to para-carcinoma colorectal tissues（15.00% and 0%），the difference was statistically signifi cant（P＜0.05）. The expression of Six1 and CyclinD1 protein was correlated with clinical stage，infi ltration depth and lymoh node metastasis（P＜0.05），but no correlated with age，sex，tumor size or degree of differentiation（P＞0.05）. Exressions of Six1 were negatively associated with expression of CyclinD1 in colorectal cancer（P＜0.05）. Conclusions The overexpression of Six1 and CyclinD1 is closely associated with occurrence and development of colorectal cancer The combined detection of Six1 and CyclinD1 expression may be used to assess the ability of invasion，metastasis and prognosis of colorectal cancer.

Colorectal cancer Six1 CyclinD1 Invasion Metastasis

317000浙江省臨海市第一人民醫院消化內科（朱鵬武吳春松）317000 浙江省臺州醫院病理科（鄭海紅）