姜黃素對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠細(xì)胞因子表達(dá)的影響

曹俊敏　楊雪靜　侯佳惠

?實(shí)驗(yàn)研究?

姜黃素對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠細(xì)胞因子表達(dá)的影響

曹俊敏楊雪靜侯佳惠

目的 探討姜黃素對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠細(xì)胞因子表達(dá)的影響，觀察姜黃素在其中所起的作用及意義。方法 選用45只清潔級(jí)ICR小鼠隨機(jī)均分為9組，每組5只。9組分別為：預(yù)防高、中、低劑量組，治療高、中、低劑量組，藥物對(duì)照組，內(nèi)毒素（LPS）對(duì)照組，空白對(duì)照組。給藥5d后眼球取血分離血清，用固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清TNF-α、IL-1、IL-6水平。結(jié)果 治療組、預(yù)防組的TNF-α、IL-1、IL-6水平較正常組高，但較LPS組低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，治療組、預(yù)防組與LPS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 姜黃素對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠有保護(hù)作用，預(yù)防、治療均有效果，預(yù)防效應(yīng)強(qiáng)于治療。

內(nèi)毒素血癥 姜黃素 小鼠

內(nèi)毒素（Lipopolysaccharide，LPS）是存在于革蘭陰性細(xì)菌胞壁外膜中的一種生物活性成分，LPS對(duì)生物體的健康危害較大，可以導(dǎo)致內(nèi)臟（肝、胰腺、腎、肺、心臟等）重要器官發(fā)生代謝障礙或功能衰竭［1］。姜黃素具有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗突變、抗艾滋病毒等［2］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合姜黃素抗炎作用的研究背景，觀察姜黃素對(duì)LPS小鼠的細(xì)胞因子的影響，以期探討姜黃素抗內(nèi)毒素的藥理機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 （1）主要試劑：姜黃素、大腸埃希菌脂多糖（LPS，O55：B5）購自美國Sigma公司。二甲基亞砜購自谷歌生物科技有限公司。TNF-α、IL-1、IL-6試劑盒購自上海研生生化試劑有限公司。（2）實(shí)驗(yàn)儀器：酶標(biāo)儀型號(hào)為BIO-RAD iMarKTM，購自美國伯樂公司。（3）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康清潔級(jí)ICR小鼠45只，平均體重（18±2）g，雌雄各半，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房。

1.2方法 （1）動(dòng)物分組及給藥：45只清潔級(jí)ICR小鼠隨機(jī)均分為9組，每組5只。9組分別為：預(yù)防高、中、低劑量組，治療高、中、低劑量組，藥物對(duì)照組，內(nèi)毒素（LPS）對(duì)照組，空白對(duì)照組。①預(yù)防劑量組：分別灌服200mg/（kg?d）、100mg/（kg?d）、50mg/（kg?d）的姜黃素，1次/d，連續(xù)5d；最后一次給藥后3h，腹腔注射LPS溶液9mg/kg。②治療劑量組：第一次給藥前3h，腹腔注射LPS溶液9mg/kg，后分別灌服200mg/（kg?d）、100mg/（kg?d）、50mg/（kg?d）的姜黃素，1次/d，連續(xù)5d。③藥物對(duì)照組：灌服200mg/（kg?d）的姜黃素，1次/d，連續(xù)5d。④LPS對(duì)照組：腹腔注射LPS溶液9mg/kg，1次/d，連續(xù)5d。⑤空白對(duì)照組：等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)5d。（2）測(cè)定血清TNF-α、IL-1、IL-6水平：采血后，分離血清，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩z測(cè)方法采用固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，后經(jīng)美國酶標(biāo)儀BIO-RAD iMarKTM測(cè)定，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各劑量組測(cè)定血清TNF-α、IL-1、IL-6水平 治療高、中、低各劑量組間比較，細(xì)胞因子水平均低于LPS組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），治療高劑量組細(xì)胞因子水平最低。預(yù)防高、中、低各劑量組間比較，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），預(yù)防高劑量組細(xì)胞因子水平最低。中、低劑量的治療、預(yù)防組與LPS對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高劑量的治療、預(yù)防組與LPS對(duì)照組比較，差異有顯著性（P＜0.01）。

2.2各組小鼠TNF-α、IL-1、IL-6的變化 治療組、預(yù)防組的TNF-α、IL-1、IL-6水平較正常組高，但較LPS組低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，治療組、預(yù)防組與LPS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1　各組小鼠TNF-α、IL-1、IL-6的變化［pg/ml，（x±s）］

3　討論

由于抗菌藥物的無節(jié)制濫用，使人體內(nèi)蓄積了大量的內(nèi)毒素，內(nèi)毒素性疾病有可能成為21世紀(jì)威脅人類的主要疾病。LPS損傷的發(fā)生、發(fā)展程度與血漿中LPS含量密切相關(guān)［3］。至今，對(duì)內(nèi)毒素血癥的治療仍無特效措施。將內(nèi)毒素注射至機(jī)體內(nèi)雖可產(chǎn)生一定量的抗體，但其抵抗內(nèi)毒素毒性的作用微弱。同時(shí)由于細(xì)菌的血清類型較多，抗原復(fù)雜，所以較難推廣［4］。

本資料結(jié)果表明，治療高、中、低各劑量組細(xì)胞因子水平均低于LPS組，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。預(yù)防高、中、低各劑量組間比較，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。治療和預(yù)防高劑量組細(xì)胞因子水平最低。中、低劑量的治療、預(yù)防組與LPS對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高劑量的治療、預(yù)防組與LPS對(duì)照組比較，差異有顯著性（P＜0.01）。治療組、預(yù)防組較正常組高，但較LPS組低，與LPS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。預(yù)防組與正常組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

LPS所引起的多種生物學(xué)效應(yīng)并非其直接作用于靶細(xì)胞的結(jié)果。其可直接對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生毒性，但通常首先是激活單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，誘導(dǎo)其分泌多種介質(zhì)，然后通過這些介質(zhì)在局部或循環(huán)中播散至機(jī)體其他部分而發(fā)揮毒性作用［5］。由LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的多種介質(zhì)中，以TNF-a、IL-1、IL-6等細(xì)胞因子與機(jī)體病理反應(yīng)關(guān)系最為密切。如果感染嚴(yán)重，批量的細(xì)菌在血中繁殖和死亡，使循環(huán)血中聚集高水平的LPS，則會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體各個(gè)部位的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子，導(dǎo)致感染性休克和多器官衰竭，甚至死亡［6］。姜黃素對(duì)多種成熟的實(shí)驗(yàn)性炎性反應(yīng)模型具有不同程度的抑制作用。

總之，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，姜黃素抗炎作用明顯，預(yù)防組和治療組均可降低炎性細(xì)胞因子的分泌，尤其是高劑量組可更好的降低細(xì)胞因子水平。預(yù)防與治療比較，預(yù)防組抗炎效應(yīng)更明顯。因此姜黃素有抗內(nèi)毒素和抗炎作用，為臨床應(yīng)用姜黃素防治內(nèi)毒素性疾病提供了理論依據(jù)。

1李凡.醫(yī)學(xué)微生物學(xué).第七版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007.12.

2鄭玉強(qiáng)，鄧立普.姜黃素藥理作用研究進(jìn)展.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13（2）：212～214.

3Jennifer H.M，Marina H，Paul H，et al.Colistin Resistance in Acinetobacter baumannii is mediated by complete loss of lipopolysaccharide production.Anti microbChemother，2010，54（12）：4971～4977.

3張順才.內(nèi)毒素基礎(chǔ)與臨床.北京：科學(xué)出版社，2003.1～21.

4蔣建新.細(xì)菌內(nèi)毒素基礎(chǔ)與臨床.北京：人民軍醫(yī)出版社，2004.8.

5Craw ford JH，Yang S，Zhou M.et al.Down regulation of hepat CYP1A2 plays an important role in inflammatory responses insepsis. Crit CareMed，2004，32（2）：502～ 508.

6William C，Aird.The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome.Blood，2003，101（10）：3765～3777.

Objective To explore the role of curcumine in the pathogenesis of experimental endotoxemia. Methods The 50 ICR strain mices were randomly individed into five groups： preventive dose group、therapeutical dose group、curcuminein control group 、untreated controls group .The rectal temperature of all animals were tested after eliminating toxic material. The animals were sacrificed at appropriate intervals up to 5days after administrations.，and the serum level of TNF-α、IL-1 and IL-6 were examined by ELISA. Results The death rate of the mices in preventive dose group、therapeutical dose group were significantly higher than those in the LPS group，and the peak is at the third day（4 d）. Conclusions The curcumine may play an important role in the process of inflammation in mice endotoxemia by endotoxin. The preventive doses and therapeutical doses were effective. The preventive doses were effective than the therapeutical doses.

Endotoxemia Curcumine Mice

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（2012ZA039）

310006 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科