茜草精油抗氧化及DNA損傷保護效果

權美平，田呈瑞

（1.陜西師范大學生命科學學院，陜西西安710119；2.陜西省多河流重點實驗室，陜西渭南714000；3.渭南師范學院化學與生命科學學院，陜西渭南714000）

茜草精油抗氧化及DNA損傷保護效果

權美平1，2，3，田呈瑞*1

（1.陜西師范大學生命科學學院，陜西西安710119；2.陜西省多河流重點實驗室，陜西渭南714000；3.渭南師范學院化學與生命科學學院，陜西渭南714000）

以水蒸氣蒸餾法提取茜草精油，以天然和合成的抗氧化劑為對照，用5種不同的抗氧化體系（DPPH、·OH和O2-·自由基，還原力和總抗氧化能力）檢測評價茜草精油的抗氧化活性；并以·OH自由基介導的pBR322質粒損傷模型進行了精油的DNA損傷保護效果的評價。結果表明：精油表現出在不同體系中以劑量依賴方式的不同程度的功效，并且對清除DPPH和·OH自由基活性較強。精油對·OH自由基介導的pBR322質粒損傷的保護效果可能源于精油對·OH自由基較好的清除作用。

茜草；精油；抗氧化活性；DNA損傷；保護效果

研究發現許多草本及藥用植物具有抗氧化屬性，主要源于其中大量的活性抗氧化劑，包括黃酮類、多酚、生物堿、花青素、萜類、類胡蘿卜素及維生素類。植物資源中的天然抗氧化劑備受關注，是因為其對人體健康的眾多益處；正常攝入的天然抗氧化劑可減少氧化應激為機體帶來的系列損傷，繼而可降低癌癥、心腦血管、糖尿病等其它與衰老先關的疾病等風險。作為人類天然抗氧化劑的主要資源，植物提取物和精油的抗氧化效果逐漸被人們所接受和認可。精油是芳香植物各組織中提取出的有香味的揮發性次級代謝產物，在民間醫藥、食品以及香料化妝品工業有著廣泛的應用。近來，關于多種精油及其組分的多功能生物活性研究成為研究熱點［1］。

中藥茜草為茜草科多年生攀援草本植物茜草（Rubia cordifolia L.）的干燥根及根莖，主根及支根長圓柱形，彎曲，外皮紅褐色，粗壯。莖生倒刺。喜生于山坡、田邊及林緣處，主產于陜西、河南、安徽、河北、山東、廣西和四川等地，其中以陜西、河南產量大而且品質優良。由于茜草干根及莖自古代就作為天然染料、食品的著色劑和藥用植物使用，它的化學成分、藥理和臨床作用已被深入系統地研究［2］。其味苦，性寒，歸肝、心經，具有涼血、止血、祛瘀、通經之功效，主治吐血、衄血、崩漏、外傷出血、經閉瘀阻、關節痹痛、跌撲腫痛等；亦具抗菌、抗癌、增強免疫、護肝、抑制人體表皮細胞增殖等生物活性。作為一種民族藥材，它有著悠久的歷史，但到目前為止還未見茜草精油的研究報道。作者以水蒸氣蒸餾法提取的精油進行抗氧化活性研究，并對·OH自由基介導的pBR322質粒損傷模型進行了精油的DNA損傷保護活性作出評價，為茜草這一天然植物資源進一步開發利用提供參考。

1　材料與方法

1.1主要材料和試劑

pBR322質粒、6×loading buffer：購于西安海寧生物有限公司；茜草：采自渭南市黃河濕地保護區；主要試劑DPPH、瓊脂糖、沒食子酸標品：均為Sigma公司產品；其余所用試劑均為分析純。

1.2主要儀器與設備

揮發油提取裝置：西安晶博生物有限公司；722型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；離心機：上海安亭科學儀器廠；KQ-200KDE型超聲波清洗器：昆山儀器廠；DYY-8B型穩壓穩流電泳儀及JY-SPCT電泳槽：北京君意東方電泳設備有限公司；FluorChem（5500）System凝膠圖像分析系統：伯樂太平洋公司。

1.3試驗方法

1.3.1茜草精油的提取采用揮發油提取器用常規水蒸氣蒸餾法提取揮發油。具體操作如下：粉碎至40目的茜草干粉40 g，浸泡4 h，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加水500 mL，加熱回流提取揮發油，回流至揮發油量不再增加，停止加熱；正己烷萃取收集，合并揮發油，以無水硫酸鈉干燥，得黃色片狀固態精油，-40℃保存備用。

1.3.2抗氧化試驗精確稱取20mg固態精油，加入10 mL DMSO配制成初始質量濃度2 mg/mL，然后用倍半法稀釋為系列濃度，精油的質量濃度范圍0.062 5～2mg/mL。

1）清除DPPH能力的測定：參照Larrauri［3］等的方法并稍作修改。分別取不同質量濃度樣品液0.5 mL與3.5 mL DPPH甲醇溶液（60μmol/L）混合，于暗室室溫放置30min后，在517 nm下測定吸光值；樣品對DPPH清除率用下式計算：

DPPH清除率（%）=［1-（A2-A1）/A0］×100

式中：A0為溶劑對照的吸光度值；A1為樣品對照吸光度值，以消除不同樣品的顏色誤差；A2為樣品溶液的吸光度值。

2）清除·OH自由基能力的測定：參照賈之慎［4］等的方法，稍作修改。吸取0.5 mL不同稀釋度的精油樣品，分別加入0.5 mL、2 mmol/L二氯化鐵溶液、0.5mL、2mmol/L過氧化氫溶液和0.5mL、6 mmol/L水楊酸溶液，再加入2.5 mL蒸餾水，混合均勻，將混合液在37℃水浴30min。設置空白對照，在510 nm處測定吸光度。·OH清除率（%）按下式計算：

·OH清除率（%）=［1-（Ai-Aj）/A0］×100

式中：Ai表示樣品和反應體系反應后吸光度；Aj表示未加過氧化氫時樣品體系的吸光度以消除樣品本色對反應體系的影響；A0表示未加樣品的反應體系的吸光度。

3）清除O2-·自由基能力的測定：按照Marklund等［5］的方法，取4.5mL Tris-HCl緩沖液（0.05mol/L、pH 8.2），25℃預熱20 min，加入不同稀釋度的樣品1.0 mL和0.4mL、0.025mol/L鄰苯三酚溶液，混勻，25℃水浴反應4min。立即加入1 mL、8 mmol/L鹽酸溶液使反應結束。并設置空白和樣品對照，于320 nm波長處測定混合液的吸光值。清除率I（%）按下式計算：

式中：Ai表示樣品和反應體系的吸光度；Aj表示未加鄰苯三酚樣品反應體系的吸光度以消除樣品本色對反應體系的影響；A0表示未加樣品的反應體系的吸光度。

4）還原力的測定：樣品提取液還原力的測定依照稍作修改的Vaquero等［6］的方法進行。取2.5 mL不同稀釋度的樣品提取液加入到裝有2.5 mL、0.2 mol/L、pH 6.6磷酸緩沖液的試管中，再加入2.5 m L 1%鐵氰化鉀溶液混合均勻。50℃反應20min后，加入2.5 mL 10%三氯乙酸，3 000 r/min離心10 min，取上清液5mL與4mL蒸餾水和0.5mL 0.1%三氯化鐵溶液混合。反應10min后，在700 nm處測吸光度。混合液的吸光度越高表示樣品提取液的還原能力越強。

5）總抗氧化能力測定（磷鉬絡合法）：參考Prieto等［7］的方法。分別取不同濃度0.4 mL樣品溶液和試劑液（0.6 mol/L硫酸，28mmol/L磷酸鈉和4 mmol/L鉬酸銨，三種試劑以1∶1∶1混合）4 mL，混勻后放置于95℃水浴鍋中恒溫90min。在695 nm下測其吸光度，并用溶劑做空白對照，抗氧化活性的高低以695 nm吸光值表示，抗氧化物質活性越強，測定的吸光度值越大。

1.3.3DNA損傷保護試驗精油對羥基自由基（·OH）介導的DNA損傷的保護作用按照文獻［8］的方法進行測定，并略作修改。在0.25 m L的離心管中分別加入1μL（0.5μg）pBR 322質粒DNA，10μL PBS緩沖液（10mmol/L，pH7.4）和5μL精油溶液，充分混勻，然后加入2μL、1mmol/L FeSO4和2μL、1 mmol/L H2O2反應結束后，取出4μL反應液與2 μL 6×上樣緩沖液混勻。然后吸取4μL置于1.0 g/dL瓊脂糖凝膠（含0.5μg/m L溴化乙啶）中于電泳緩沖液（TAE，Tris/acetate/EDTA）中電泳50 min。電泳結束，用凝膠成像儀成像，并進行半定量分析。空白對照管用PBS代替多酚提取液，正常對照管用PBS代替多酚提取液、FeSO4和H2O2。按下式計算保護率：

式中：S為完整pBR322質粒DNA雙螺旋構象的灰度值；Sp為FeSO4+H2O2+pBR322質粒DNA體系中雙螺旋構象的灰度值；S0為精油+FeSO4+H2O2+ pBR322質粒DNA體系中雙螺旋構象的灰度值。

1.4總酚含量測定

精油總酚含量的測定以福林酚法進行，將0.3 mL精油（1 mg/m L）、2.5 m L去離子水和0.3 mL 1.0 mol/L Foloin-Ciocalteu試劑混合均勻。靜置8 min后，加入1.5 m L、7.5 g/dL Na2CO3溶液，搖勻，密封，室溫下避光反應60min后，于760 nm處測定吸光值。精油總酚含量以標準品沒食子酸質量濃度（mg/mL）表示。

1.5統計學處理

實驗數據以平均值±標準差表示，數據處理應用EXCEL進行；保護率采用化學發光儀凝膠成像系統自帶軟件的灰度進行分析。

2　結果與分析

2.1茜草精油的得率與形態

以水蒸氣蒸餾法可得茜草精油（REO）的提取率0.12%，密度測定為0.896 g/mL。由圖1可知室溫條件下茜草精油的顏色及狀態。左為黃色、薄片狀結晶固態精油，具有特殊的刺激性芳香氣味；中為從精油提取器收集，干燥后的精油樣品，顏色黃中略紅；右為茜草精油在DMSO溶解條件下的狀態。茜草精油為精油中為數不多的固態精油種類，Huaiqiong Chen等［9］從健康的沉香木中所提取的精油即為固態精油，但目前大多數的研究報告證明芳香植物精油以液態精油占絕大多數。

2.2茜草精油的抗氧化活性

2.2.1清除DPPH自由基活性DPPH是一種非常穩定的自由基體系，現在被廣泛用作衡量抗氧化劑自由基清除活力的有效工具。不同質量濃度的精油和陽性對照清除DPPH自由基能力見圖2所示。精油、VC和BHT清除DPPH能力與所試質量濃度呈劑量依賴效應，在低質量濃度范圍內量效關系增加明顯；精油在低質量濃度范圍（＜0.125 mg/mL）內，對DPPH自由基清除力明顯低于VC和BHT，以VC的清除活力最強；但在高質量濃度范圍內（＞0.125 mg/ mL），精油對DPPH自由基清除活力高于BHT，而低于VC，表現出強的DPPH自由基清除活力，在質量濃度為0.25 mg/mL時，精油的清除率高達（85.75± 1.13）%，VC為（95.73±2.07）%，BHT為（80.43± 1.29）%，綜上可知，精油具有較強的DPPH自由基清除活力。

圖1　茜草精油在室溫下的色澤和狀態Fig.1　Coulor and state of Rubia cordifolia essential oil（REO）at room tem perature

圖2　茜草精油、VC和BHT對DPPH自由基的清除效果Fig.2　Scavenging effects on DPPH radical by REO，VC and BHT

2.2.2清除·OH自由基活性羥基自由基（·OH）是目前已知化學性質最活潑的活性氧自由基，它可以攻擊生物細胞內的多糖、蛋白質、核酸等生物大分子，使其產生過氧化變性、交聯或斷裂，從而導致機體出現多種疾病［10］。不同質量濃度的精油和陽性對照清除·OH能力見圖3。在測試質量濃度范圍內，精油、VC、BHT清除羥基自由基的能力隨樣品質量濃度增大而逐漸增強，在質量濃度＞0.25mg/mL時，VC對羥基自由基的清除能力明顯大于其它二者；而質量濃度＜0.25 mg/mL時，三者的清除能力相當甚至精油效果更好，在質量濃度為0.062 5 mg/mL是，精油的清除率為（42.73±2.14）%，VC的清除率為（33.52±1.56）%，BHT的清除率為（27.13±1.07）%；精油在所試濃度范圍內清除率在（42.73±2.14）%～（87.76±2.24）%。

圖3　茜草精油、VC和BHT對·OH自由基的清除效果Fig.3　Scavenging effects on hyd roxyl radical by REO，VC and BHT

2.2.3清除O2-·自由基活性超氧自由基（O2-·）作為眾多活性氧前體物質，會促進組織的損傷和多種疾病的發生，是目前所知對細胞和組織是非常有害的一類自由基。不同質量濃度的精油和陽性對照清除O2-·自由基能力見圖4。在所試質量濃度范圍內，VC、BHT清除O2-·自由基的能力隨質量濃度增大而逐漸增強，而樣品精油的劑量依賴效應不明顯；三者清除O2-·的強弱順序依次為BHT＞VC＞精油；VC、BHT和精油的清除率變化范圍分別是：（7.16± 1.02）%～（95.46±0.51）%，（13.77±1.40）%～（97.87± 0.95）%和（2.59±0.50）～（9.89±0.95）%。

圖4　茜草精油、VC和BHT對O2-·自由基的清除效果Fig.4　Scavenging effects on superoxide radical by REO，VC and BHT

2.2.4還原性Fe（III）的還原用于表示捐獻電子活性強弱的指標，此活性是酚類抗氧化劑作用的重要機制之一，而且此指標可以衡量其抗氧化活性的強弱［10］。不同質量濃度的精油和陽性對照的還原能力見圖5。精油、VC和BHT的還原能力與所試質量濃度呈劑量依賴效應，但精油的劑量效應性關系不明顯，其在所試質量濃度范圍內吸光值僅從0.277升高至0.369，而VC（0.299～0.603）和BHT（0.198～0.705）的變化要更明顯。同質量濃度范圍下（＜1mg/mL），還原能力的大小順序為VC＞BHT＞精油。

圖5　茜草精油、VC和BHT的還原能力Fig.5 Reducing power of REO，VC and BHT

2.2.5總抗氧化能力（磷鉬絡合法）磷鉬絡合物法的測定原理是Mo（Ⅵ）被抗氧化物質還原生成綠色的Mo（Ⅴ）絡合物，其最大吸收波長為695 nm。此方法操作簡單，所用試劑低廉、方法重現性好且適合多種溶劑提取試液抗氧化活性的測定。不同質量濃度的精油和陽性對照的總抗氧化能力見圖6。精油、VC和BHT總抗氧化能力與所試質量濃度呈劑量依賴效應；三者的總抗氧化活性順序為：VC＞精油＞BHT。精油在所試質量濃度范圍內的A695的變化范圍0.225～0.953。

圖6　茜草精油、VC和BHT的總抗氧化力Fig.6 Total antioxidant capacity of REO，VC and BHT

2.3精油對羥基自由基（OH·）介導的DNA損傷的保護作用

由圖7可以看出，正常pBR322質粒DNA主要以雙螺旋形態為主（Lane 1），被·OH氧化損傷后，雙螺旋轉變成了開環和線型的DNA分子，表明鐵離子介導的H2O2分解后產生的·OH使pBR322質粒DNA的單鏈和雙鏈都發生了斷裂。然而，添加了精油后，未觀察到雙鏈斷裂后的線型DNA分子，表明精油可以保護·OH介導的DNA雙鏈的損傷。

圖7　茜草精油對羥基自由基（·OH）介導的DNA損傷的保護作用Fig.7·OH med iated DNA dam age protective effect of REO

為進一步研究精油對·OH介導的DNA損傷的保護作用，采用凝膠成像系統對試驗結果進行了半定量分析，結果見圖8。精油對·OH介導的DNA損傷的保護作用以保護率表征，保護率越高，表明其對DNA損傷的保護作用越強。由圖8可以看出，在測試質量濃度范圍內，精油對·OH介導的DNA損傷都具有不同程度的保護作用，但是與劑量依賴性作用不明顯，保護率范圍在（70.2±0.85）%～（79.5± 1.06）%，表明精油具有較好的對·OH介導的DNA損傷保護作用。對于抗氧化的研究已經表明，精油具有清除羥基自由基能力。在該體系中，精油可能通過提供氫原子或電子直接清除羥基自由基來保護DNA的損傷［11］。

圖8　茜草精油對羥基自由基（·OH）介導的DNA損傷保護作用的半定量分析Fig.8 Sem i-quan titative analysis of·OH med iated DNA damage protective effect of REO

2.4精油總酚含量

按照上述福林酚法測定沒食子酸的標準曲線方程為：y=8.481 7x+0.088 2（R2=0.996 7）；試驗所測定的精油總酚含量為：1 g精油=0.22 mg/mL沒食子酸當量。研究表明［12］：總酚含量是主要的天然抗氧化活性成分。植物提取物中總酚含量的高低常可以解釋其抗氧化活性及生物活性的強弱，總酚含量與生物活性間有很強的正相關性。

3　結語

抗氧化活性的測定雖有多種方法，但對同一種抗氧化劑，選擇不同的底物（或基質）體系，采用不同的測定方法，有時獲得的結果也不盡相同［13］。因此，采取多種不同的抗氧化體系客觀全面地反映和衡量所測定抗氧化劑的抗氧化活性非常重要。作者用5種不同的抗氧化體系評價精油的抗氧化活性，并與人工合成的抗氧化劑2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）和天然抗氧化劑VC進行對比，結果證明茜草精油具有較好的清除DPPH自由基和羥基自由基的生物活性，但清除超氧陰離子的能力較差，總抗氧化能力和還原能力相對陽性對照活性一般。大量研究分析表明［1，14］：精油中化合物多為抗氧化劑，且植物提取物中存在的天然抗氧化劑與該藥用植物的有益屬性密切相關，所以抗氧化活性被廣泛作為衡量食品及藥用植物生物有效性的有用參數。作者繼而對·OH介導的DNA損傷的保護作用進行評價的結果說明：精油具有較好的對·OH介導的DNA損傷保護作用的機理可能在于精油具有較好的清除羥基自由基能力。

大量的植物活性物質成分研究分析表明：植物界的酚類化合物是植物發揮抗氧化潛力的主要源泉，是發揮抗氧化活性的主要貢獻和參與者［10］，抗氧化活性的強弱與酚類含量緊密相關；其余的生物活性如不同自由基介導的DNA損傷保護作用的發揮也與多酚含量息息相關，如gao等［8］證明了黃參籽多酚提取物不同的多酚濃度對兩種自由基介導的DNA損傷保護效果研究證明：酚類物質對DNA損傷的保護具有一定程度的貢獻作用。本研究測定出茜草精油的多酚含量為1 g精油=0.22 mg/mL沒食子酸當量，或許精油中的多酚含量可以解釋和支撐茜草精油的抗氧化和DNA損傷保護的活性效果。本研究的結果是關于茜草精油抗氧化及DNA損傷活性的首次報道，此精油表現出一定程度的抗氧化活性，表明此植物精油或許有作為食品、藥品和化妝品添加劑的可能性。

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會議信息

韓國擬實施食品原材料肯定列表制度

10月15日，韓國KFDA發布了《食品規格及基準部分修改》相關行政預告，其主要內容如下：

1.食品原材料的管理由以往的逐個審批變更為肯定列表方式。目前食品原材料分為可使用原材料、暫定可使用原材料、不允許使用原材料3個類別，計劃整合可使用原材料、暫定可使用原材料做成可用于食品的原材料肯定列表。該肯定列表將收載可使用原材料4461種和暫定可食用原材料183種，共4644種。

2.具體步驟是把目前建設當中的食品原材料數據庫整合到食品法典中，作為食品原材料使用的法律依據，也便于企業和消費者迅速查詢和確認是否允許使用。

3.未收載在肯定列表中的食材，按照《食品等的暫定基準及規格認證基準》規定程序，向KFDA提交證明安全性等材料進行審批。

此外該行政預告案還包括，新設了冬季、雨季用糖飼養蜂蜜等食品類型；修改了農藥殘留限量；葡萄酒生產加工中為了增香允許使用橡木片（棒）等內容。

［信息來源］食品伙伴網.韓國擬實施食品原材料肯定列表制度［EB/OL］.（2015-10-15）.http：//news.foodmate.net/ 2015/10/333872.htm l

歐盟批準二甘醇乙醚用于所有產肉動物

10月10日歐盟發布委員會實施條例（EU）2015/1820，修訂（EU）No37/2010關于二甘醇乙醚（Diethylene glycol monoethyl ether）的殘留限量規定。

目前歐盟已批準二甘醇乙醚用于反芻動物與豬。歐盟委員會認為，無需制定相應的殘留限量規定。

歐洲藥品管理局收到要求將二甘醇乙醚用于家禽的申請。歐洲藥品管理局經評估認為，擴大其使用范圍至家禽仍安全，由此判斷二甘醇乙醚用于所有產肉動物合理。

本法規自發布20日起生效。

［信息來源］食品伙伴網.歐盟批準二甘醇乙醚用于所有產肉動物［EB/OL］.（2015-10-13）.http：//news.foodmate.net/ 2015/10/333442.htm l

Antioxidant Activity and DNA Dam age Protective Effect of Essential Oil from Rubia cordifolia

QUAN Meiping1，2，3，TIAN Chengrui*1
（1.College of Life Science，Shanxi Normal University，Xi'an 710062，China；2.Key Lab ofWet Land Ecology and Environment of Duoheliu of Shanxi Province，W einan 714000，China；3.College of Chem istry and Life Science，Weinan NormalUniversity，Weinan 714000，China）

The antioxidantactivity and DNA damage protective effect of the essential oil from the roots of Rubia cordifolia（REO）by hydrodistillation were studied.Five different antioxidant systems，evaluated by DPPH radical method，·OH and O2-·scavenging activity，reducing power assay and the FRAP assay were employed in order to evaluate the antioxidant activities of the essential oil as compared with natural and synthetic antioxidants.The DNA damage protective activity of essential oil was evaluated by pBR322 plasm id induced by·OH radicals.The results revealed that the oil exhibited varying degrees of efficacy in each assay and a dose-dependent free-radical-scavenging activity against DPPH radical，superoxide anions and hydroxyl radical，as well as the oil exerted more potent radical scavenging activity against DPPH and·OH radicals than thatagainstO2-·radical.The essentialoilexhibited significantprotectiveactivity against·OH radical induced DNA damage.Themechanism may be originated from the superior ability of essential oil toscavenge·OH radicals.

Rubia cordifolia L.，essentialoil，antioxidantactivity，DNA damage，protectiveeffect

R 284

A

1673—1689（2015）11—1225—07

2015-07-09

渭南市科技創新扶持項目（2013JCYJ-14）；渭南師范學院教育教學改革項目（JG201515）。

權美平（1978—），女，陜西咸陽人，副教授，植物資源開發與利用博士研究生。

田呈瑞（1955—），男，陜西周至人，教授，博士研究生導師，主要從事食品新資源的開發利用方面的研究。E-mail：327311912@qq.com