黑曲霉-葡萄糖苷酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)

劉中美，謝夢圓，周哲敏

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122）

黑曲霉-葡萄糖苷酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)

劉中美，謝夢圓，周哲敏*

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122）

“綠色資源”纖維素廣泛應(yīng)用于能源、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域，β-葡萄糖苷酶（BGL）作為纖維素降解酶系的限速酶是當(dāng)前研究熱點之一。作者對黑曲霉利用豆渣發(fā)酵所產(chǎn)的胞外β-葡萄糖苷酶進(jìn)行分離純化，并對該酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)表征。實驗結(jié)果表明，BGL最適反應(yīng)溫度為55℃，最適反應(yīng)pH為2.0～2.5，pH穩(wěn)定范圍為2.0～7.5。在最適反應(yīng)條件下，Km值為8.4×10-4mol/L，kcat為16 s-1，催化效率kcat/Km為1.92×104L/（mmol·s）。相比較其他報道的BGL酶，該酶具有更好的耐酸性能，可為BGL的理論研究與酶制劑的生產(chǎn)應(yīng)用提供一定基礎(chǔ)。

β-葡萄糖苷酶；對硝基苯-β-D吡喃葡萄糖苷；分離純化；酶學(xué)性質(zhì)

纖維素類物質(zhì)是自然界中存在的一類最豐富、最廉價的綠色資源，有效科學(xué)地利用纖維素資源已經(jīng)成為當(dāng)前的熱點研究。纖維素可由纖維素酶降解成為單糖，再通過微生物發(fā)酵應(yīng)用于諸多領(lǐng)域，如燃料、食品、醫(yī)藥、化工原料、飼料等［1-2］。纖維素糖化主要通過纖維素酶系中的內(nèi)切葡聚糖酶（Cx）、外切葡聚糖酶（C1）和β-葡萄糖苷酶的協(xié)同作用。纖維素降解時，纖維二糖的積累會抑制內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶的活性，而β-葡萄糖苷酶可以水解纖維二糖，實現(xiàn)纖維素的徹底降解，是纖維素降解的限速酶［3］。除了具有纖維素酶制劑的巨大市場潛力之外，β-葡萄糖苷酶還廣泛應(yīng)用于飼料、飲料增香劑、龍膽低聚糖和紅景天等糖苷類物質(zhì)合成、臨床診斷和治療等多個領(lǐng)域。

β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，BGL，EC 3.2.1.21）可以催化水解非還原性的β-D-糖苷鍵，同時釋放出β-葡萄糖和相應(yīng)的配基。對β-葡萄糖苷酶的研究可以追溯到1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中發(fā)現(xiàn)該酶［4］。后來大量研究表明，它廣泛存在于植物、昆蟲、酵母、曲霉、細(xì)菌體內(nèi)，微生物來源的BGL酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于植物來源的酶。目前為止，已經(jīng)有近百個動植物和微生物體內(nèi)的BGL得到了分離純化、基因克隆、酶學(xué)性質(zhì)測定。BGL的相對分子質(zhì)量一般在40 000～250 000之間，最適反應(yīng)溫度一般在30～65℃，最適反應(yīng)pH值為4～7.5，而在pH 4～9可以保持穩(wěn)定。大部分的BGL的p I值都在酸性范圍內(nèi)，并且變化不大，一般在3.5～5.5［5-7］。

近年來，國內(nèi)外多家研究機(jī)構(gòu)致力于BGL的分子生物學(xué)研究和開發(fā)應(yīng)用，期望增加其酶活性，提高纖維素酶降解效率，更有效地利用纖維素資源。作者從一株黑曲霉（Aspergillus niger）發(fā)酵液中分離純化出β-葡萄糖苷酶，該酶具有非常好的耐酸性能，在pH 2.0～7.5環(huán)境中酶活力穩(wěn)定，可以為BGL的進(jìn)一步理論研究和工業(yè)應(yīng)用提供一定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株實驗所用菌種為作者所在實驗室分離、選育得到的黑曲霉（Aspergillus niger）。

1.1.2試劑與儀器對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG），胰蛋白酶：購自上海生物工程公司，其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

Purifier AKTA蛋白純化系統(tǒng)：通用電氣（中國）醫(yī)療器械集團(tuán)；HiTrap Q HP（1 mL）：通用電氣（中國）醫(yī)療器械集團(tuán)；高速冷凍離心機(jī)：THERMO公司；UV1100紫外-可見分光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司；MALDI-TOF/TOF：美國布魯克道爾頓公司。

1.1.3主要培養(yǎng)基CYM培養(yǎng)基（菌種保藏用）：葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，酵母膏2 g，七水硫酸鎂0.5 g，磷酸氫二鉀1.0 g，磷酸二氫鉀0.46 g，瓊脂20 g。豆渣培養(yǎng)基：豆渣2 g，純水100 m L于500 mL三角瓶中，氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至5.8。

1.2方法

1.2.1發(fā)酵與分離純化將平板保藏的菌種黑曲霉連同培養(yǎng)基的基內(nèi)菌絲轉(zhuǎn)接到盛有無菌水和小玻璃珠的三角瓶中，均勻振蕩，使菌體破碎并且進(jìn)入無菌水中。取混有菌體菌絲的的混合液0.5mL接種到豆渣培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min搖床培養(yǎng)5 d。

抽濾發(fā)酵液，將粗酶液與冰凍乙醇以1∶1.5的比例互溶，在4℃條件下，10 000 r/min離心后用20 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.5）復(fù)溶沉淀，再次離心取上清液，用0.22μm過濾膜過濾。利用離子交換層析柱HiTrap Q HP純化目的蛋白質(zhì)，用含有0.4 mmol/L NaCl的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）進(jìn)行線性洗脫。按峰收集樣品，將收集的樣品進(jìn)行SDS-PAGE及活性分析。蛋白質(zhì)定量采用常規(guī)的Bradford法，采用牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。

1.2.2溫度對酶活影響以pNPG為底物，用比色法測定酶活力［8］。取酶液400μL，加入50mmol/L鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸緩沖液（pH 2.5）1.2 mL，50 mmol/L pNPG 400μL，55℃下反應(yīng)5 min后加入6%碳酸鈉4mL終止反應(yīng)。測定OD400nm處吸光度，用加熱滅活的純酶液作對照。一個單位酶活力定義為：每分鐘產(chǎn)生1μmol對硝基苯所需酶量。

將酶反應(yīng)體系置于25～75℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)5 min。以酶活最高時的反應(yīng)溫度為最適反應(yīng)溫度作為100%參照酶活，做出相對酶活力隨溫度變化的曲線圖，每組樣品做3個平行樣實驗。

1.2.3pH對酶活影響將酶反應(yīng)體系在pH 1.0～6.5條件的緩沖液中55℃進(jìn)行酶促反應(yīng)5 min。以酶活最高時的反應(yīng)pH為最適反應(yīng)溫度，記為100%參照酶活，做出相對酶活力隨pH值變化的曲線圖。

1.2.4酶的熱穩(wěn)定性將純酶液分別在室溫、35、40、45℃的條件下保溫20～60 min，加入底物pNPG進(jìn)行酶促反應(yīng)。以未保溫酶液的酶活為100%參照酶活，做出在不同的溫度下殘余酶活力隨著保溫時間的延長而不斷變化的曲線圖。

1.2.5酶的酸堿穩(wěn)定性將純酶液于pH 2.0～8.5的緩沖液中，4℃保溫12 h后進(jìn)行酶促反應(yīng)。以未處理的酶液的酶活為100%參照酶活，比較不同pH處理后的酶活的殘余量。

1.2.6酶促動力學(xué)參數(shù)測定將純酶液分別與0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mmol/L pNPG進(jìn)行酶反應(yīng)：55℃、pH 2.5、5 min。以滅活純酶液作為空白組。測定動力學(xué)參數(shù)，根據(jù)米氏方程擬合出Km和Vmax值，并計算出kcat。

1.2.7質(zhì)譜鑒定切下電泳膠上目標(biāo)條帶和空白膠（對照），加入100 mmol/L NH4HCO3/30%ACN脫色，清洗至透明。加100 mmo/L NH4HCO390μL，100 mmol/L DTT 10μL，56℃孵化30 min，還原蛋白質(zhì)；去除上清液，加100%ACN 100μL，5 min后吸去；加100 mmol/L NH4HCO370μL，200 mmol/L IAA 30μL，室溫避光處20min；去上清液后加入100 mmol/L NH4HCO3100μL，室溫15 min；去上清液后加入100%ACN 100μL，5 min后吸去，凍干。凍干后，加入0.01 mg/mL胰蛋白酶5μl，置于4℃冰箱60 min；待膠塊充分吸脹后加入25 mmol/L NH4HCO3（pH 7.8）30μL，37℃保溫20 h。吸出酶解液移至新EP管中，在原管中加入60%ACN/0.1% TFA 100μL，超聲15min，吸出溶液。將兩次上清液合并后凍干。復(fù)溶，點樣，進(jìn)行質(zhì)譜分析。

2　結(jié)果與討論

2.1分離純化

發(fā)酵所用黑曲霉菌株具有很好的耐酸性，在培養(yǎng)基初始pH值為5時，仍能正常產(chǎn)酶。通過乙醇沉淀和QHP離子交換層析后，以pNPG作為底物，檢測到一個峰具有BGL酶活，該峰的SDS-PAGE結(jié)果見圖1，該蛋白酶相對分子質(zhì)量接近120 000。

圖1　純化后BGL電泳圖Fig.1　SDS-PAGE of purified BGL

2.2β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1溫度對酶活的影響如圖2所示，在25～55℃范圍內(nèi)，隨溫度的升高，酶反應(yīng)速度加快，55℃時酶活力達(dá)到最大。隨著溫度繼續(xù)升高，酶活力降低，當(dāng)溫度達(dá)到75℃時酶活力基本為0。由此可見，BGL的最適反應(yīng)溫度為55℃。

圖2　溫度對β-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.2　Effectof tem perature on the purifiedβ-glucosidase

2.2.2pH對酶活的影響β-葡萄糖苷酶處于pH 2.0～4.0的時候，酶活力可達(dá)到80%以上，在pH 1.5以下以及pH 4.5以上的條件下，活性迅速降低。如圖3所示，該酶的最適反應(yīng)pH為2.0～2.5，具有良好的耐酸性。

圖3　pH值對β-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.3　E ffect of pH on the purifiedβ-glucosidase

2.2.3酶的熱穩(wěn)定性圖4表明，該酶的熱穩(wěn)定性較差，35℃以下保溫1 h后酶活力基本不變，經(jīng)過45℃處理1 h后僅能保留35%的酶活。

2.2.4酶的酸堿穩(wěn)定性圖5表明，該酶的穩(wěn)定范圍很廣，在pH 2.0～7.5酶活力保持在90%以上，pH 7.5以上酶活力迅速降低。

2.2.5β-葡萄糖苷酶動力學(xué)參數(shù)在pH 2.5，55℃的反應(yīng)條件下，β-葡萄糖苷酶水解pNPG的動力學(xué)參數(shù)見表1。

圖4　β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性Fig.4　Effect of tem perature on stability ofβ-glucosidase

圖5　β-葡萄糖苷酶的酸堿穩(wěn)定性Fig.5 Effect of pH on stability ofβ-glucosidase

表1　β-葡萄糖苷酶的動力學(xué)參數(shù)Table 1 K inetic param eters ofβ-glucosidase

2.3質(zhì)譜鑒定

使用Mascot算法在NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中收索到兩個同源性高的蛋白質(zhì)：gi78172198和 gi7009581，進(jìn)一步驗證分離出的是來源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶，結(jié)果見圖6。

gi78172198（unpublished）是Yan等與2005年錄入的氨基酸序列，和gi7009581（JBC，275：4973-4980，2000）都是860個氨基酸，相對分子質(zhì)量約為93 000，序列比對發(fā)現(xiàn)兩者同源性高達(dá)97.33%。文獻(xiàn)［9］對gi7009581進(jìn)行了基因克隆、測序、以及保守催化位點的鑒定，但并未對酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行詳細(xì)的研究。

圖6　質(zhì)譜鑒定Fig.6 M ALDI-TOF/TOF analysis

3　結(jié)語

對黑曲霉發(fā)酵豆渣所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度、最佳反應(yīng)pH、熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性等基本酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，最后確定了其動力學(xué)參數(shù)。以pNPG為底物，該酶的最適溫度為55℃，最適pH為2.0～2.5。該酶在35℃及以下溫度可以長時間保存，在pH 2.0～7.5環(huán)境中酶活力穩(wěn)定。相對于目前報道的其他β-葡萄糖苷酶在pH 4～9中保持穩(wěn)定，該酶所具的耐酸性能非常優(yōu)越。不僅對理論研究具有重要意義，而且具有工業(yè)應(yīng)用的潛在價值。

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會議信息

會議名稱（中文）：第八屆中國工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展高峰論壇

開始日期：2015-12-11結(jié)束日期：2015-12-12

所在城市：天津市和平區(qū)

具體地點：空港經(jīng)濟(jì)區(qū)濱海圣光皇冠假日酒店

主辦單位：中國科學(xué)院科技促進(jìn)發(fā)展局、中國生物工程學(xué)會

承辦單位：中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所、中國生物工程學(xué)會生物技術(shù)與生物產(chǎn)業(yè)信息工作委員會、中國生物工程學(xué)會生物產(chǎn)業(yè)促進(jìn)工作委員會

聯(lián)系人：吳崇明

聯(lián)系電話：022-24828778，18618264714

傳真：022-84861996

E-MAIL：biotech@tib.cas.cn

會議網(wǎng)站：http：//www.cas.cn/xs/201509/t20150918_4426804.shtm l

會議背景介紹：“中國工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展高峰論壇”是中國科學(xué)院原生命科學(xué)與生物技術(shù)局聯(lián)合國家發(fā)改委高技術(shù)產(chǎn)業(yè)司、科技部中國生物技術(shù)發(fā)展中心、中國生物工程學(xué)會等部門共同精心打造的工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域的品牌性年度論壇。自2007年起，在天津、湖州、青島、成都等地已成功舉辦七屆。論壇旨在為我國工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域的專家、學(xué)者、金融界和企業(yè)界人士提供一個高水平的交流平臺，增強(qiáng)工業(yè)生物技術(shù)集成創(chuàng)新能力與成果轉(zhuǎn)化能力，推進(jìn)我國工業(yè)生物技術(shù)的發(fā)展，為生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供新動力。“第八屆中國工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展高峰論壇”將于2015年12月11-12日（暫定）在天津舉辦。論壇擬以新思路、新概念重塑品牌，實現(xiàn)“定位準(zhǔn)、有實效、有影響、有期盼”的目標(biāo)。在“中國制造2025”已經(jīng)出臺和國家“十三五”規(guī)劃即將發(fā)布的大背景下，本次論壇將邀請國際專家、國內(nèi)管理專家、經(jīng)濟(jì)學(xué)家及行業(yè)領(lǐng)軍企業(yè)做主旨報告，發(fā)布《中國工業(yè)生物技術(shù)白皮書》，組織“技術(shù)與政策”、“技術(shù)與金融”、“技術(shù)與裝備”及“技術(shù)與前沿”四大板塊討論，還將舉行“創(chuàng)新·創(chuàng)業(yè)”——新工業(yè)企業(yè)自強(qiáng)發(fā)展分論壇、“分子·細(xì)胞·系統(tǒng)”——新生物學(xué)研究熱點與難點分論壇和“e＋時代·依勢帶”——工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)互聯(lián)網(wǎng)＋分論壇等三個分論壇活動。論壇組委會將樹立“從簡、務(wù)實”會風(fēng)，采取多種組織形式，加強(qiáng)互動交流，力爭辦成一屆有新意、有成效的論壇。

Purification and Characterization of β-Glucosidase from Aspergillus niger

LIU Zhongmei，XIEMengyuan，ZHOU Zhemin*
（Schoolof Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

Cellulose is one of the most popular-used biomass resource and widely applied in the bioethanol production，medicine，and food industry.Theβ-glucosidase（BGL）is of interest as the key enzyme in conversion of cellulose to glucose.In this study，glucosidase from Aspergillus niger in bean dregs broth was purified and characterized.The optimum temperature was 55℃，and the optimum pH was 2.0～2.5.BGL was stable at pH 2.0～7.5，The Kmvalue was 8.4×10-4mmol/L，the kcatvaluewas16 s-1and the catalytic efficiency（kcat/Km）was 1.92×104L/（mmol·s）in the optimum condition.This study could promote the theoretical research and the production and application of BGL.

β-glucosidase，pnitrophenylβ-D-glucopyranoside，purification，enzymatic properties

Q 55

A

1673—1689（2015）11—1198—05

2014-07-12

教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金項目（第47批）；江南大學(xué)自主科研青年基金項目（JUSRP1001）。

劉中美（1978—），女，山東蓬萊人，理學(xué)博士，副教授，主要從事生物酶學(xué)與蛋白質(zhì)工程方面的研究。E-mail：zliu@jiangnan.edu.cn

周哲敏（1969—），男，河北石家莊人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事生物酶學(xué)與酶工程方面的研究。

E-mail：zhmzhou@jiangnan.edu.cn