化學修飾提高谷氨酰胺轉胺酶活性與熱穩(wěn)定性

劉松，堵國成*，陳堅

（1.江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122）

化學修飾提高谷氨酰胺轉胺酶活性與熱穩(wěn)定性

劉松1，2，堵國成*1，2，陳堅1，2

（1.江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122）

谷氨酰胺轉氨酶（EC 2.3.2.13，簡稱TGase）是一種催化轉酰基反應，導致蛋白質分子間發(fā)生交聯(lián)的酶，廣泛應用于食品、紡織、皮革、醫(yī)藥等領域。為提高TGase比活力與熱穩(wěn)定性，作者以鄰苯二甲酸酐為修飾劑，對重組吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）TGase分子賴氨酸殘基進行化學修飾。確定最佳修飾條件為：pH 8.0、20℃修飾反應2 h、TGase表面氨基與PA摩爾比為1∶2。無胱胺（TGase的競爭性抑制劑）存在時，PA修飾使TGase比活力提高48.3%；10 mmol/L胱胺存在時，PA修飾使TGase熱穩(wěn)定性提高31.3%。晶體模擬結構顯示，21個賴氨酸殘基位于S.hygroscopicus TGase分子表面，其中5個位于催化活性中心附近區(qū)域。表面疏水性分析發(fā)現(xiàn)，不同條件的PA修飾使TGase分子表面疏水度降低9.46%～21.13%。因此，PA可能通過改變TGase分子不同區(qū)域的疏水性來提高其比活力和熱穩(wěn)定性的。上述結果表明，PA修飾是一種改進TGase酶學性質的有效策略，為其后續(xù)的分子改造提供了一定的理論參考。

谷氨酰胺轉胺酶；鄰苯二甲酸酐；比活力；熱穩(wěn)定性；表面疏水度

谷氨酰胺轉胺酶（EC 2.3.2.13，簡稱TGase）是一種可以催化轉酰基反應，從而導致蛋白質（或多肽）之間發(fā)生共價交聯(lián)的酶。由于TGase具有獨特的催化功能，已在眾多領域得到應用。其中TGase在食品加工領域中的應用最為廣泛，少量添加即可顯著提高肉制品、水產(chǎn)品和豆制品等食品的感觀品質或營養(yǎng)價值［1-2］。近年來，TGase在一些非食品加工領域也具有很大的應用前景，包括組織工程、紡織與皮革加工和蛋白質工程等，成為羊毛纖維強化、皮革填充和組織工程的關鍵用酶［3］。基于應用性能和生產(chǎn)成本的優(yōu)勢，微生物發(fā)酵（如鏈霉菌等）是TG工業(yè)化生產(chǎn)的首選方法。隨著應用領域的拓展，各種應用環(huán)境對TGase酶分子穩(wěn)定性和催化活性不斷提出新的要求［3］。如何獲得高穩(wěn)定性、高催化的TGase成為國外研究者關注的熱點。

一系列分子改策略已應用于TGase熱穩(wěn)定性和催化活性的改造，如基于分子柔性區(qū)域分析的定點突變、基于水接觸表面熱點區(qū)域的定點突變、基于易錯PCR的定向進化技術等［4］。通過上述分子改造，鏈霉菌TGase的熱穩(wěn)定性和催化活性獲得不同程度的提高。然而，基于基因工程的酶分子改造策略僅能使關鍵氨基酸位點產(chǎn)生20種主要的氨基酸更替，修飾程度有限。酸酐等化學修飾劑對蛋白質中氨基酸側鏈的修飾，可引入幾乎無限種的基團，被廣泛用于酶分子穩(wěn)定性、底物親和性、催化效率和底物選擇性的改進［5］。因此，化學修飾可能是一種提高TGase熱穩(wěn)定性和催化活性的有效策略。

在前期研究中，作者將吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）TGase成功表達于大腸桿菌［6］，為發(fā)酵法制備TGase提供了高效生產(chǎn)菌株。為進一步提高S.hygroscopicus TGase的應用性能，作者將重組S.hygroscopicus TGase純化后，考察了常用氨基修飾劑——鄰苯二甲酸酐（PA）對其比酶活力及熱穩(wěn)定性的影響，并探討了其作用機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質粒菌株E.coli（pET-22b/sprostg）為作者所在實驗室保藏，用于發(fā)酵生產(chǎn)重組S.hygroscopicus TGase［7］。

1.1.2主要試劑N-carboxybenzoyl-L-glutaminylglycine（N-CBZ-Gln-Gly）和L-谷氨酸-γ-單羥胺酸：購自Sigma-Aldrich公司（上海）；谷胱甘肽（還原型）：購自華美生物工程有限公司；標準相對分子質量蛋白質、蛋白質上樣緩沖液、制膠試劑：均購自碧云天公司；胰蛋白胨和酵母粉：購自Oxoid（英國）公司；其它試劑均為國產(chǎn)或進口分裝。

1.1.3培養(yǎng)基

1）LB培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/LNaCl，高壓蒸汽滅菌。

2）TB培養(yǎng)基：12 g/L蛋白胨、24 g/L酵母提取物、10 g/L甘油；磷酸鹽緩沖液：17mmo/L KH2PO4、72mmol/L K2HPO4。將前三者按比例配好后，高壓蒸汽滅菌，與經(jīng)高壓蒸汽滅菌后的磷酸鹽緩沖液按10∶1比例混合。

1.2方法

1.2.1重組TGase的制備

1）重組TGase粗酶液制備：根據(jù)前期研究中的產(chǎn)酶條件［7］，對E.coli（pET-22b/spro-stg）進行搖瓶發(fā)酵。取E.coli BL21（DE3）（pET-22b/spro-stg）發(fā)酵液于4℃、10 000 r/min離心10min收集菌體。每克濕菌體用10 m L結合緩沖液（pH 7.4，20 mmol/L Na2HPO4，200 mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑）重懸，超聲破碎至菌體完全裂解。裂解液于4℃、10 000 r/min離心10min，取上清液過0.22μm膜制成粗酶液。

2）親和層析：將樣品注入經(jīng)結合緩沖液平衡的親合層析柱（HisTrapTMFF crude，GE），并用結合緩沖液洗去未結合蛋白；隨后以0～500mmol/L咪唑溶液進行梯度洗脫，流速為1.0 m L/min，收集含有TGase催化活性的部分。

3）凝膠過濾：用pH 7.0、50 mmol/L磷酸緩沖液平衡凝膠柱，將親和純化后的樣品注入凝膠柱（Superdex 75 10/300 GL，GE），用平衡緩沖液洗脫，流速0.5 mL/min，收集含有TGase催化活性的部分。1.2.2重組TGase的化學修飾分別在含10 mmol/L胱胺和不含胱胺的情況下，按照修飾劑鄰苯二甲酸酐（PA）與TGase表面氨基1∶1、2∶1和5∶1的比例向2 mL TGase酶液（質量濃度1 mg/mL，含100mmol/L硼酸鹽，pH 8.0）中添加PA，20℃反應2 h，并將反應產(chǎn)物在50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0）緩沖液中透析過夜。

1.2.3TGase溫度穩(wěn)定性的測定將酶液在不同溫度下保溫不同時間，迅速冷卻，pH 6.0、37℃測定殘余TGase酶活，以未保溫的酶活力為相對酶活100%，計算相對酶活力。

1.2.4酶分子表面疏水度測定采用疏水性熒光探頭1-苯胺基-8-萘黃酸（ANS）測定蛋白質表面疏水度［8］。將TGase酶液（1 mg/mL）稀釋至0.5～0.005 mg/mL，每3 mL TGase稀釋液中添加40μL 8.0 mmol/L ANS溶液（0.1 mol/L、pH 7.0磷酸緩沖溶液）。在365 nm（激發(fā)）和484 nm（發(fā)射）下測定樣品的熒光吸收強度。熒光強度對蛋白質濃度的初始斜率（通過線性回歸計算）作為酶蛋白表疏水度指數(shù)。

1.2.5酶分子表面氨基修飾度的測定采用三硝基苯磺酸（TNBS）顯色法測定TGase分子表面自由氨基的修飾度［9］。將0.5mL（0.5mg/mL）樣品溶液加至0.5mL硼砂-NaOH緩沖液中，再加入20μL（1.8 mol/L TNBS），并迅速混合。反應5 min后，加2 mL終止液終止反應，于420 nm下測定吸光值。吸光值對應TGase分子表面殘余的自由氨基數(shù)量，天然TGase在420 nm吸光值對應23個氨基。化學修飾度以修飾后酶分子表面殘余自由氨基數(shù)目表示。

1.2.6蛋白質濃度與SDS-PAGE電泳檢測采用Bradford法測定蛋白質濃度［10］。SDS-PAGE電泳凝膠采用碧云天試劑盒制備，具體操作參考產(chǎn)品說明書和文獻［11］。使用濃縮膠質量濃度為5 g/dL，分離膠質量濃度為12 g/dL，以0.1%考馬斯亮藍R-250進行染色。

1.2.7TGase酶活測定比色法測定酶活［12］。用α-N-CBZ-Gln-Gly為作用底物，L-谷氨酸-γ-單羥胺酸做標準曲線。1個單位TGase酶活定義為：37℃每分鐘催化底物形成1μmol L-谷氨酸-γ-單羥胺酸的酶量（U/mL）。酶活測定條件：37℃條件下反應10min。

2　結果與分析

2.1重組S.hygroscopicus TG的制備

E.coli BL21（DE3）（pET-22b/protg）重組菌經(jīng)離心、破壁、膜過濾等預處理后，進行親和層析和凝膠過濾純化。SDS-PAGE分析見圖1，純化后重組TGase的相對分子質量為38 000，與S.hygroscopicus天然TGase基本一致［13］。重組TGase的比酶活從0.57 U/mg提高到19.1 U/mg，純化33.8倍，回收率為32%。

圖1　重組S.hygroscopicus TGase的SDS-PAGE電泳分析Fig.1　SDS-PAGE analysis of the purified recombinant TGase

2.2PA修飾反應條件的確定

PA修飾反應條件包括反應pH、溫度和時間等，見圖2。為確保蛋白質分子表面氨基不帶電荷，修飾反應體系的pH值不能偏低。結合S.hygroscopicus TGase的最適反應pH和pH穩(wěn)定范圍［13］，確定PA修飾反應體系的pH值為8.0。在pH 8.0、PA與TGase表面氨基比例為2∶1（摩爾比）時，PA修飾反應溫度和時間對TGase活力的影響見圖3。修飾溫度較低時（10℃），TGase活力變化較小；修飾溫度較高時（37℃），TGase活力下降；過長的修飾時間（120min）同樣導致TGase活力降低。因此，確定PA修飾TGase的條件：pH 8.0、20℃修飾2 h。

圖2　PA修飾酶分子自由氨基Fig.2　Chem icalmodification of free am ino-group of enzyme by phthalic anhydride

圖3　PA修飾時間和溫度對TGase活力的影響Fig.3　Effects of PA modification time and temperature on TGase activity

2.3PA對TGase酶學性質的影響

選取三個濃度的PA對TGase分子進行修飾。胱胺是TGase的競爭性抑制劑［14］，其與TGase的結合可能影響PA對酶活性中心附近氨基的修飾。因此，考察了胱胺對PA修飾TGase的影響。結果顯示，無胱胺存在時，經(jīng)PA修飾TGase的比酶活力有明顯提高，且熱穩(wěn)定性也略有提高；其中，TGase表面氨基與PA摩爾比為1∶2時，TGase比活力較天然酶提高48.3%，見圖4（a）。存在10 mmol/L胱胺時，PA修飾使TGase的熱穩(wěn)定性有不同程度的提高；TGase表面氨基與PA摩爾比為1∶2時熱穩(wěn)定性提高31.3%，見圖4（b）。

2.4PA修飾的作用機制解析

S.hygroscopicus TGase的模擬結構顯示，其催化活性基團Cys65位于酶分子裂縫底部，5個賴氨酸殘基（Lys295、Lys 270、Lys328、Lys38、Lys217和Lys237）位于裂縫附近的分子表面，見圖5。在S.mobaraensis TGase分子中，將其裂縫表面的氨基酸殘基突變?yōu)槭杷园被釟埢⊿er299Phe等）可提高酶對含苯環(huán)底物CBZ-Gln-Gly的催化活性［15］，暗示裂縫表面是TGase的底物結合位點。PA對裂縫表面賴氨酸殘基的修飾同樣增加了疏水性的苯環(huán)，該區(qū)域疏水性提高顯然有利于其與CBZ-Gln-Gly的結合，最終使TGase催化活性提高。然而，胱胺與TGase催化活性中心的結合可能阻礙了PA對該區(qū)域的修飾，因此TGase催化活性變化較小。

圖4　胱胺（10 mmol/L）不存在（a）或存在（b）時PA修飾對TGase催化活力及熱穩(wěn)定性的影響Fig.4　Effects of phthalic anhydride modification on TGase activity and thermal stability in the absence（a）or presence（b）of cystam ine（10 mmol/L）

圖5　位于S.hygroscopicus TGase分子表面（模擬結構）的賴氨酸殘基Fig.5 Lysine residues on surface of S.hygroscopicus TGase（modeling structure）

PA修飾對酶分子熱穩(wěn)定的提高一般基于兩個方面的原因：1）PA修飾引入的苯甲酸基團易于與其基團形成氫鍵，使分子結構穩(wěn)定性提高［16］；2）PA修飾帶入的電荷可增強酶分子間的靜電斥力，抑制高溫條件下酶分子的聚集［17］。此外，分子表面疏水性的降低也有可能促進酶熱穩(wěn)定性的提高［18］。表1顯示，無論胱胺是否存在，PA修飾均可提高TGase分子表面親水性。胱胺不存在時，TGase表面氨基與PA摩爾比為1∶1、1∶2和1∶5時，PA修飾度隨PA比例的提高而增加，相應TGase分子分表面疏水度下降了9.46%、17.74%和21.13%；在含10 mmol/L胱胺的體系中，TGase表面氨基與PA摩爾比為1∶1、1∶2和1∶5時，PA修飾度隨PA比例的提高同樣增加，相應TGase分子分表面疏水度分別下降了15.01%、19.67%和21.38%。結果表明，PA修飾后對TGase熱穩(wěn)定性的提高可能與其表面親水性的增加有關。值得注意的是，隨著酶分子表面疏水度的下降，TGase在無胱胺存在時熱穩(wěn)定性提高并不明顯。這可能是由于，在無胱胺存在時PA對TGase催化活性中心的修飾降低了酶分子的熱穩(wěn)定性，從而一定程度上抵消了表面疏水下降引起的熱穩(wěn)定性增量。

3　結語

1989年，日本味之素公司首次在土壤中分離到TGase生產(chǎn)菌株，Streptoverticillium mobaraense S-8112［19］。此后，研究者不斷分離到新的TGase生產(chǎn)株菌，包括Sv.ladakanum［20］，Streptomyceshygroscopicus［21］，Bacillus circulans［22］，Bacillus subtilis［23］等，生產(chǎn)周期短、成本優(yōu)勢明顯的微生物發(fā)酵成為TGase的主要來源。隨著應用成本的下降，TGase應用領域不斷拓展，包括食品、紡織、皮革、醫(yī)藥等領域。如何提高熱穩(wěn)定性、比酶活力等應用性能，成為TGase研究的重要方向。本研究首次采用PA對重組S.hygroscopicus TGase氨基進行化學修飾，使其比活力和熱穩(wěn)定性分別提高48.3%和31.3%，表明化學修飾是一種改進TGase酶學性質的有效策略。目前，已有多種酸酐類化學修飾劑（如檸康酐、琥珀酸酐、馬來酐等）用于辣根過氧化物酶［24］、木瓜蛋白酶［25］等酶的耐有機環(huán)境性能、pH穩(wěn)定和熱穩(wěn)定性等酶學性質的改造，獲得了較好的研究結果。因此，全面考察檸康酐、琥珀酸酐、馬來酐等修飾劑對TGase酶學性質的影響，可能進一步獲得多種酶學性質改良的TGase酶。作者還發(fā)現(xiàn)了表面親水性與TGase的正相關性，將為TGase分子的理性改造提供明確耙點。基于此，可采用定點突變的策略將TGase分子表面賴氨酸殘基突變?yōu)槠渌H水性更強的氨基酸殘基（如谷氨酸殘基），以提高酶的熱穩(wěn)定性。

表1　PA對TGase分子表面疏水度的影響Table 1 Effect of PA modification on the surface hydrophobicity of TGasemolecule

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Chemical Modification of Transglutaminase for Improving Specific Activity and Thermal Stability

LIU Song1，2，DU Guocheng*1，2，CHEN Jian1，2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，M inistry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122，China；2.Schoolof Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

Transglutam inase（EC 2.3.2.13，TGase）can catalyze the acyl transfer reaction and leads to the crosslinking among proteins.It has been w idely used in food，textile，leather，and pharmaceutical industry.In order to improve the specific activity and thermal stability，a recombinant Streptomyces hygroscopicus TGase chem ically wasmodified by phthalic anhydride（PA）in this study.The optimalmodification condition of the cultivation was at pH 8.0，20℃for 2 h，and the molar ratio of surface-am ine to phthalic anhydride 1∶2.In the presence of 10mmol/L of cystam ine，which is a competitive inhibitor of the TGase，the thermal stability of TGase was increased 31.3%after the PA modification，whereas specific activity of the TGase increased 48.3%in the absence of the cystam ine.The modeling crystal structure showed that 21 lysine residues existed in surface of S.hygroscopicus TGase，and five of them located at region close the active site.The analysis of surface hydrophobicity indicated that PA modification reduced the surface hydrophobicity from 9.46%to 21.13%.Thus，PA may improve the specific activity and thermal stability of TGase by modifying the surface hydrophobicity at different regions.These results suggested that PA modification was an effective way to improve the catalytic properties of TGase，which provided a theoretical reference formolecularmodification.

transglutam inase，phthalic anhydride，specific activity，thermal stability，surface hydrophobicity

Q 814

A

1673—1689（2015）11—1135—06

2014-06-07

國家自然科學基金項目（31171639）；江蘇省自然科學基金項目（BK20130132）。

劉松（1981—），男，湖南永州人，工學博士，主要從事發(fā)酵工程方面的研究。E-mail：liusong@jiangnan.edu.cn

堵國成（1965—），男，江蘇常州人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事代謝工程、發(fā)酵過程優(yōu)化與控制等方面的研究。E-mail：gcdu@jiangnan.edu.cn