豬苓菌絲體發酵條件的優化

豆宏瑤，高慧娟，黃金梅，楊國紅，徐建梅

（河西學院農業與生物技術學院，甘肅張掖734000）

豬苓菌絲體發酵條件的優化

豆宏瑤，高慧娟*，黃金梅，楊國紅，徐建梅

（河西學院農業與生物技術學院，甘肅張掖734000）

以菌絲體干重為評價指標，研究不同發酵條件對豬苓菌絲體干重的影響。試驗采用了液體搖瓶培養的方法，在不同的溫度、pH、裝液量和培養時間的條件下，測定豬苓菌絲體干重的，確定各單因素條件下豬苓菌絲體的最佳發酵條件，再采用L9（34）正交試驗設計優化菌絲體發酵條件。結果表明，當溫度為25℃、裝液量為100 mL/250 mL、pH為5.5、培養時間11 d時，為菌絲體最優發酵條件，進一步在此條件下進行驗證性試驗得菌絲體干重為1.023 g/100 mL，說明通過優化發酵條件，可以有效提高豬苓菌絲體干重量。

豬苓；菌絲體：液態發酵；正交試驗

豬苓Polyporus umbellate（Pers.）Fries屬真菌門，多孔菌科，豬苓（地花）屬，別名野豬糞［1］。豬苓作為常用中藥，在我國已有2000多年的入藥歷史。現代醫學研究表明，豬苓具有利尿、抗腫瘤、保護肝臟、增強免疫力、抗輻射等作用［2-3］。除多糖外，甾體類為其主要化學成分，生物活性多樣，幾乎無毒副作用，在臨床上具有廣泛用途和良好療效，是一種很具開發潛力的常用中藥［4］。

近年來豬苓的藥用價值越來越受到人們的重視［5］。由于豬苓以野生為主，野生產量日漸匱乏，人工栽培的時間短，產量低，引種產量少，致使豬苓的上市量呈逐年下滑之勢，豬苓的人工栽培也面臨著嚴峻的挑戰，而采用液態發酵技術大規模培養菌絲體，培養過程容易控制，且成本低，可以獲得大量菌絲體［6］，而豬苓菌絲體量受環境條件的影響較大［7］，本研究通過單因素試驗和正交試驗優化菌絲體發酵條件，為大批量生產豬苓菌絲體提供一定的參考。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1儀器

HZQ-X400型恒溫振蕩培養箱：太倉市華美生化儀器廠；DHP-9162型電熱恒溫培養箱、DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海齊欣科學儀器有限公司；CL-32L型高壓滅菌鍋：ALP公司；5A2003型精密電子天平：沈陽龍騰電子有限公司；pH分析測量儀：上海盛磁儀器有限公司；SKJH-2112型超凈工作臺。

1.1.2菌株

豬苓：河西學院應用真菌工程實驗室提供。

1.1.3化學試劑

95%乙醇，葡萄糖，瓊脂，NaOH，HCl均為分析純。

1.1.4培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加水定容至1 000 mL。

1.2方法

1.2.1PDA培養基的配制

馬鈴薯洗凈，去皮挖眼，切成2 cm2的小塊，放入水中煮沸30 min，用玻璃棒攪拌以防糊底，然后用雙層紗布過濾，取其濾液加入葡萄糖2%，瓊脂2%，加自來水定量至1 000 mL，pH為自然。

1.2.2菌種活化

將保存于4℃冰箱中的豬苓種菌塊接入新鮮的固體斜面培養基上，置于28℃恒溫培養箱中避光培養8天后，再轉接一次，28℃培養待菌絲長滿斜面時，置于4℃冰箱備用。

1.2.3發酵條件對菌絲體干重的影響

1.2.3.1溫度對菌絲體干重的影響

在250 mL三角瓶中，加入100 mL的PDA培養基，115℃濕熱滅菌20 min，冷卻至室溫后，接入3片6 mm的菌絲塊。置于130 r/min的恒溫培養振蕩器上，分別在22、25、28、31、34℃的條件下進行培養，每個溫度梯度設3個平行。8天后測定菌絲體干重，以確定菌絲體最佳發酵溫度。

1.2.3.2裝液量對菌絲體干重的影響

在250 mL三角瓶中，分別加入50、75、100、125、150 mL的PDA培養基，115℃濕熱滅菌20 min，冷卻至室溫后，接入3片6mm的菌絲塊。每個裝液量梯度設3個平行，采用1.2.3.1的最佳發酵溫度置于130 r/min的恒溫培養振蕩器上進行培養。8天后測定菌絲體干重，以確定菌絲體最佳發酵裝液量。

1.2.3.3pH對菌絲體干重的影響

在250 mL三角瓶中，加入1.2.3.2的最佳裝液量的培養基，115℃濕熱滅菌20 min，冷卻至室溫后，接入3片6 mm的菌絲塊。設置pH分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5 5個梯度，每個梯度設3個平行。以1.2.3.1的最佳發酵溫度，置于130 r/min的恒溫培養振蕩器上進行培養，8天后測定菌絲體干重，以確定菌絲體最佳發酵初始pH。

1.2.3.4發酵時間對菌絲體干重的影響

在250 mL三角瓶中，加入1.2.3.2的最佳裝液量的培養基，將pH調至1.2.3.3的最佳pH，115℃濕熱滅菌20 min，冷卻至室溫后，接入3片6 mm的菌絲塊。以1.2.3.1的最佳發酵溫度置于130 r/min的恒溫培養振蕩器上培養，培養時間分別設定為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 d，同一培養時間設定3個平行。測定菌絲體干重，以確定最佳發酵時間。

1.2.4菌絲體干重的測定

搖床培養結束后，將發酵液過濾，蒸餾水反復洗滌菌球后，置于55℃烘箱中烘干至恒重，稱重得到菌絲體干重。

1.2.5豬苓菌絲體發酵條件正交試驗的設計

在單因素試驗基礎上，采用正交試驗，以發酵的溫度、裝液量、pH和培養時間為考察因素進行優化發酵條件的設計，每因素選取3個水平，設計因素水平見表1。

表1　豬苓菌絲體發酵條件的正交試驗設計Table 1Fermentation conditions for mycelium of Polyporus umbellate by orthogonal experimental design

2結果與分析

2.1溫度對豬苓菌絲體生長量的影響

培養溫度22℃～32℃范圍內豬苓菌絲體均能生長，在22℃～25℃內菌絲體量變化不大，在25℃～28℃內菌絲體量呈明顯增長趨勢，28℃菌絲體含干重達最大值，28℃后又呈現下降趨勢，結果見圖1。

圖1　溫度對豬苓菌絲體生長量的影響Fig.1Effect of Temperature on fermentation conditions for mycelium of polyporus umbellate

由圖1可知菌絲體量隨溫度的上升而下降，這可能是高溫引起某些酶失活進而影響了菌絲體的生長，低溫會影響物質的溶解性，物質只有溶于水才能被菌絲體吸收，物質的溶解度隨溫度變化而變化，最終影響菌絲體生長，低溫也會影響細胞質膜的流動性［8］，溫度的變化影響營養物質的吸收與代謝產物的分泌。由此得到豬苓菌絲體的最佳發酵溫度為28℃。

2.2裝液量對豬苓菌絲體的生長量的影響

在豬苓液體發酵過程中，豬苓菌絲體干重量呈弓形趨勢變化，裝液量為50 mL～100 mL時，菌絲體量隨裝液量的增加而不斷上升；裝液量為100 mL時，豬苓菌絲體干重達最大值；裝液量為100 mL～150 mL時，菌絲體量隨裝液量的增加而不斷減少，結果見圖2。

圖2　裝液量對豬苓菌絲體生長量的影響Fig.2Effect of fluid volume on fermentation conditions for mycelium of polyporus umbellate

由圖2可知，說明裝液量少，發酵液中氧氣的交換率較強，有足夠的空間提供氧氣量，菌絲體生長旺盛；裝液量多，氧氣交換率較弱，供氧空間越來越小［9］，越不利于豬苓菌絲體的生長。由此得到豬苓菌絲體發酵的最佳裝液量為100 mL。

2.3pH對豬苓菌絲體生長量的影響

豬苓菌絲體量在初始pH3.5～pH4.5之間呈上升趨勢，在pH4.5時菌絲體干重達到最大值，pH4.5以后菌絲體量又呈現下降趨勢，結果見圖3。

圖3　發酵pH對豬苓菌絲體生長量的影響Fig.3Effect of pH on fermentation conditions for mycelium of polyporus umbellate

由圖3可知，初始pH太大或太小均不利于胞外多糖的形成，一般認為，微生物機體內的絕大多數反應是酶促反應，而酶促反應都有一個最適pH，低于或高出這個范圍，其生長就會受到抑制，并且環境中的酸堿度也會影響到菌絲體細胞膜的滲透性以及膜結構的穩定性和物質的溶解性或電離性。豬苓菌絲體發酵的最適pH為4.5，這與真菌一般偏酸性環境生長，最適pH多為4.0～6.0相一致。由此得到豬苓菌的最適發酵pH為4.5。

2.4培養時間對豬苓菌絲體生長量的影響

菌絲體量隨著培養時間的增加不斷增大，6天之前菌絲體量少且變化不大，6 d～9 d菌絲體量呈上升趨勢且顯著增多，培養到10天時菌絲體干重達到最大值，10天后菌絲體量略呈現下降趨勢，結果見圖4。

圖4　培養時間對豬苓菌絲體生長量的影響Fig.4Effect of Culture time fermentation conditions for mycelium of polyporus umbellate

由圖4可知，分析記錄菌絲體的生長狀況，菌絲體在培養7天后其生長速度加快，菌絲潔白、生長旺盛，在培養11天后，菌絲體逐漸變成灰白色［10］，生長速度也變得緩慢，意味著菌絲體生長速度減緩，開始老化現象。由此得到豬苓菌的最適培養時間為10 d。

2.5正交試驗結果分析

由表2可知，各因素的極差不相等，因素C的極差最大，因素D的極差的最小，這說明各因素水平改變對試驗結果的影響是不相同的，極差越大，表示該列因素的數值在試驗范圍內的變化，將導致試驗指標在數值上具有更大的變化［11］。通過正交試驗極差分析法獲得優化方案A1B2C3D3，即在溫度25℃下加入pH 5.5的PDA培養基100 mL/250 mL置于液體搖床發酵11 d測得菌絲體干重為1.023 g/100 mL。對比正交試驗9個方案中的5號方案A2B2C3D1，發現其與優化方案的發酵條件非常相似，但菌絲體含量遠不及驗證試驗的菌絲體含量。優化方案并不包含在正交表中已做過的9個試驗方案中，這正體現了正交設計表的優越性。

表2　正交試驗結果Table 2The result of orthogonal experimental

對正交試驗進行方差分析，結果顯示，初始pH和裝液量對結果的影響極顯著，溫度對結果的影響顯著，時間對結果的影響差異不顯著，結果見表3。

表3　正交試驗的方差分析表Table 3Variance analysis of orthogonal experiment

因此確定液體發酵豬苓的最佳條件為溫度25℃，裝液量100 mL，pH5.5，培養時間11 d。

3結論

不同單因素對菌絲體干重的影響不同，經過單因素試驗得到溫度為28℃時，菌絲體干重達最大值0.435 g/100 mL；裝液量為100 mL時，菌絲體干重達最大值0.639 g/100 mL；pH為4.5時，菌絲體干重達最大值0.639 g/100 mL；培養時間為10 d時，菌絲體干重達最大值0.479 g/100 mL。

在單因素試驗的基礎上，進行正交試驗優化最佳發酵條件為：溫度25℃、pH5.5、裝液量100 mL及發酵11 d，通過驗證試驗測得菌絲體干重為1.023 g/100 mL，對比正交試驗方案中最高值0.908 g/100 mL增加了12.6%，說明優化豬苓菌絲體發酵條件能夠有效的提高菌絲體量。

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Optimization of Fermentation Conditions for Mycelium of Polyporus umbellate

DOU Hong-yao，GAO Hui-juan*，HUANG Jin-mei，YANG Guo-hong，XU Jian-mei
（College of Agriculture＆Biotechnology，Hexi University，Zhangye 734000，Gansu，China）

The study aim to obtain the optimal of fermentation conditions for mycelium of Polyporus umbellatus by investigating effects of different fermentation conditions on mycelium of Polyporus umbellatus，with mycelium as an indicator.In this study，the liquid shake flask culture method was used.In different conditions（various temperatures，pH，fluid volume and incubation times），the mycelium of Polyporus umbellatus was determined to find the best fermentation condition for fermentation in each single factor.Subsequently，the mycelium fermentation conditions were optimized by using L9（34）orthogonal experiment design，and the results showed that the optimal fermentation conditions for mycelium of Polyporus umbellatus were temperature of 25℃，pH of 5.5，incubation time of 11 d and fluid volume of 100 mL/250 mL.So，content of mycelium of Polyporus umbellatus reached the maximum 1.023 g/100 mL，suggesting that optimization of fermentation conditions for mycelium of Polyporus umbellatus could effectively improve content of mycelium of Polyporus umbellatus.

Polyporus umbellatus；mycelium；liquid fermentation；orthogonal experiment

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.028

2014-03-04

豆宏瑤（1995—），女（漢），在讀本科生，研究方向：食品工程。

高慧娟（1977—），女（漢），副教授，碩士研究生，研究方向：微生物發酵。