脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成工藝優化

王麗君

（淄博職業學院，山東淄博255314）

脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成工藝優化

王麗君

（淄博職業學院，山東淄博255314）

對脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯工藝進行研究。以酯化率為參考指標，考察了在有機介質中不同脂肪酶催化合成亞麻酸枇杷甾醇酯，確定脂肪酶pseudomonas為催化劑。通過響應面分析法確定脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯的最佳工藝，即在正己烷溶劑體系中，脂肪酶用量為7.8%，酸醇摩爾比為2.6∶1，反應溫度為50.0℃，反應時間為52.5 h，此時亞麻酸枇杷甾醇酯的酯化率達到79.59%。

亞麻酸枇杷甾醇酯；酶催化；合成；響應面優化

枇杷在我國的產量豐富，枇杷甾醇是其中的功能性成分，具有較好的降低血膽固醇作用［1］。然而枇杷甾醇在脂肪或水中的溶解度較差，限制了它的應用。亞麻酸是人體必須營養素之一，具有提高免疫功能、抗癌、抗糖尿病等功效，但是亞麻酸的氧化穩定性較差［2］。枇杷甾醇與亞麻酸酯化成溶解性較好的甾醇酯，能夠在保留兩者優良生物活性的同時，有效地解決它們在實際應用中的難題［3］。生物酶法催化合成甾醇酯的條件溫和、反應選擇性高、能耗低、無溶劑污染，因而受到越來越多的關注。目前，已有學者利用亞麻酸與菜籽甾醇［4］、豆甾醇［5］等植物甾醇催化合成植物甾醇酯的研究，但亞麻酸枇杷甾醇酯的合成還未見報道。因此，本試驗在有機介質中，探索不同脂肪酶的催化效果，利用響應面分析法優化脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯的合成工藝條件，以期為枇杷資源開發提供一些理論參考。

1材料及方法

1.1原料與試劑

枇杷甾醇：實驗室提供；

亞麻酸：購于青島諾金化工有限公司；脂肪酶Novozyme435：購于諾維信酶制劑有限公司；脂肪酶pseudomonas：購于丹麥Novo公司；脂肪酶AYS、脂肪酶AY-30G、脂肪酶A6：購于日本Amano公司；脂肪酶Lipase AK：購于美國Sigma公司；

正己烷、二十六烷、乙醇、環己烷、無水乙醚、NaHCO3溶液、硅膠等：淄博職業學院實驗室提供。

1.2試驗儀器與設備

JJ-160精密增力電動攪拌器：天津騰博實驗器材有限公司；GCMS-QP2010SE氣相色譜質譜聯用儀：日本島津公司；HH-2恒溫水浴鍋：上海科鑫機械有限公司，等。

1.3試驗方法

1.3.1亞麻酸枇杷甾醇酯的合成［6］

以枇杷甾醇、亞麻酸為原料，脂肪酶作催化劑，將它們溶解于正己烷中，加內標二十六烷，置于連接有電動攪拌器、溫度計、油水分離器的三口燒瓶中，水浴加熱，開啟攪拌器、恒溫控制，進行酯交換反應，反應結束后，離心，取上層油狀物，冷卻，得到亞麻酸枇杷甾醇酯粗品。

1.3.2亞麻酸枇杷甾醇酯的純化［7］

亞麻酸枇杷甾醇酯粗品經2%NaHCO3溶液和乙醇洗滌，離心，棄下層清夜，上層濾餅加入蒸餾水，除鹽，再次離心，濾餅真空干燥至恒重，加環己烷溶解，硅膠柱層析分離，流動相為環己烷/無水乙醚，收集洗脫液，待測。

1.3.3亞麻酸枇杷甾醇酯的氣相色譜（GC）分析和酯化率計算

上述純化后的亞麻酸枇杷甾醇酯用正己烷稀釋一定倍數，進行氣相色譜分析［8］：

色譜條件：Rxi-17型毛細管色譜柱（15m×0.25mm× 0.25 μm）；FID檢測器溫度380℃；進樣口溫度350℃；進樣量1.0 μL；載氣為高純度氮氣；恒壓模式；分流比10∶1；H2流速30 mL/min，柱流速1.0 mL/min，尾吹氣氮氣，流速20 mL/min。升溫程序：初始溫度200℃，保持2 min，以3℃/min的速度升至350℃，保持5 min。

酯化率=［1-（W2-W1）］×100%，式中：W1為反應前體系中枇杷甾醇的含量；W2為反應后體系中枇杷甾醇的含量。

1.3.4篩選催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的脂肪酶

參考有關文獻［9］，分別選取脂肪酶Novozyme435、脂肪酶pseudomonas、脂肪酶AYS、脂肪酶AY-30G、脂肪酶A6、脂肪酶LipaseAK這6種酶，在正己烷體系中，亞麻酸為1.0 mmol，枇杷甾醇為1.0 mmol，脂肪酶用量為底物混合物總量的5%，在反應溫度為45℃，250 r/min下恒溫攪拌48 h。以酯化率為指標，篩選出催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的脂肪酶。

1.3.5脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成工藝的優化

根據單因素試驗，選取脂肪酶用量、酸醇摩爾比、反應溫度、反應時間4個因素的最優試驗范圍，以酯化率為優化指標，采用響應面分析法對脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成工藝條件進行優化。

2結果與分析

2.1篩選催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的脂肪酶

分別選取肪酶Novozyme435、脂肪酶pseudomonas、脂肪酶AYS、脂肪酶AY-30G、脂肪酶A6、脂肪酶Lipase AK，按照1.3.1方法進行亞麻酸枇杷甾醇酯的合成，不同脂肪酶對催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的酯化率影響結果如圖1所示。

圖1　脂肪酶種類對酯化率的影響Fig.1Influence of different kinds of lipase on the yield of esterification

由圖1可知，當脂肪酶pseudomonas作為催化劑時，酯化率值較高。這是可能是由于脂肪酶pseudomonas以高催化速率水解不溶于水的長鏈酯類化合物而促進亞麻酸枇杷甾醇酯的合成，提高了酯化率。因此，選擇脂肪酶pseudomonas作為催化劑。

2.2脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成工藝的優化試驗

2.2.1脂肪酶用量對合成亞麻酸枇杷甾醇酯效果的影響

設定合成亞麻酸枇杷甾醇酯時，酸醇摩爾比為3∶1，反應溫度為50℃，反應時間為24 h，分別在脂肪酶用量為2%、4%、6%、8%、10%、12%6個梯度下，按1.3.1和1.3.2合成亞麻酸枇杷甾醇酯并測其酯化率，脂肪酶用量對合成亞麻酸枇杷甾醇酯效果的影響結果如圖2所示。

圖2　脂肪酶用量對酯化率的影響Fig.2Effect of enzyme amount on the yield of esterification

由圖2可以看出，當脂肪酶用量為8%，酯化率達到最大且之后逐漸減小。因此，脂肪酶酶催化合成亞麻酸枇杷甾醇酯的最佳脂肪酶用量為8%。

2.2.2酸醇摩爾比對合成亞麻酸枇杷甾醇酯效果的影響

設定合成亞麻酸枇杷甾醇酯時，脂肪酶用量為8%，反應溫度為50℃，反應時間為24 h，分別在酸醇摩爾比為1∶1、3∶1、5∶1、7∶1、9∶1、11∶1 6個梯度下，按1.3.1和1.3.2合成亞麻酸枇杷甾醇酯并測其酯化率，酸醇摩爾比對合成亞麻酸枇杷甾醇酯效果的影響如圖3所示。

圖3　酸醇摩爾比對酯化率的影響Fig.3Effect of molar ratio of linolenate to phytosterol on the yield of esterification

由圖3可以看出，當酸醇摩爾比為3∶1時，酯化率達到最大。因此，選擇合成亞麻酸枇杷甾醇酯的酸醇摩爾比為3∶1。

2.2.3反應溫度對合成亞麻酸枇杷甾醇酯效果的影響

設定合成亞麻酸枇杷甾醇酯時，脂肪酶用量為8%，酸醇摩爾比為3∶1，反應時間為24 h，分別在反應溫度為40、45、50、55、60、65℃6個梯度下，按1.3.1和1.3.2合成亞麻酸枇杷甾醇酯并測其酯化率，反應溫度對合成亞麻酸枇杷甾醇酯效果的影響如圖4所示。

圖4　反應溫度對酯化率的影響Fig.4Effect of reaction temperature on the yield of esterification

由圖4可以看出，當反應溫度為50℃時，亞麻酸枇杷甾醇酯合成效果較好。

2.2.4反應時間對合成亞麻酸枇杷甾醇酯效果的影響

設定合成亞麻酸枇杷甾醇酯時，脂肪酶用量為8%，酸醇摩爾比為3∶1，反應溫度為50℃，分別在反應時間為12、24、36、48、60、72 h 6個梯度下，按1.3.1和1.3.2合成亞麻酸枇杷甾醇酯并測其酯化率，反應時間對合成亞麻酸枇杷甾醇酯效果的影響如圖5所示。

由圖5可以看出，當反應時間為48 h時，亞麻酸枇杷甾醇酯合成效果較好。

圖5　反應時間對酯化率的影響Fig.5Effect of reaction time on the yield of esterification

2.2.5脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的條件優化

結合單因素試驗的結果，分別選取脂肪酶用量為6%、8%、10%，酸醇摩爾比為1∶1、3∶1、5∶1，反應溫度為45、50、55℃，反應時間為36、48、60 h，利用響應面分析法優化脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的最佳工藝參數。響應面實驗因素水平見表1，結果見表2，回歸方程各項的方差分析見表3。

表1　響應面因素水平Table 1Response surface factors level and coding

表2　脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成試驗設計及結果Table 2Test design and results of catalyzed synthesis of phytosterol linolenate esters

表3　回歸方程各項的方差分析Table 3The variance analysis of regression equation

對脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成條件進行分析，脂肪酶用量，酸醇摩爾比、反應溫度、反應時間都是顯著因素。關于亞麻酸枇杷甾醇酯的酯化率二次回歸擬合方程：

酯化率/%=77.20-2.85×A-2.57×B-2.40×C+ 5.41×D+8.57×A×B+4.46×A×C-2.52×A×D-0.66×B×C-4.43×B×D+1.61×C×D-8.09×A2-5.66×B2-3.29×C2-4.48× D2（式中：A為脂肪酶用量，B為酸醇摩爾比C為反應溫度；D為反應時間。）

由表3可以看出，模型的P值為＜0.000 1，而失擬項的P值為0.060 6，說明了脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的模型與實際情況擬合程度比較好，可以預測脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的條件。

由方差分析結果可以看出，AB的交互作用、AC的交互作用、AD的交互作用、BC的交互作用、BD的交互作用、CD的交互作用都顯著，相應曲面圖見圖6至圖11。

根據脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的試驗結果和回歸方程各項的方差分析，由響應面分析法優化出脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的最佳工藝條件，即脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的最佳工藝條件為脂肪酶用量為7.8%，酸醇摩爾比為2.6∶1，反應溫度為50.0℃，反應時間為52.5 h。

圖6　脂肪酶用量與酸醇摩爾比交互作用對酯化率影響的響應面Fig.6Response surface of effect of enzyme amount and molar ratio of linolenate to phytosterol interaction on the yield of esterification

圖7　脂肪酶用量與反應溫度交互作用對酯化率影響的響應面Fig.7Response surface of effect of enzyme amount and reaction temperature interaction on the yield of esterification

圖8　脂肪酶用量與反應時間交互作用對酯化率影響的響應面Fig.8Response surface of effect of enzyme amount and reaction time interaction on the yield of esterification

2.2.6驗證試驗

為驗證響應面分析法優化出脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的最佳工藝條件的可靠性，根據響應面優化條件驗證試驗設計表（表4）進行驗證試驗。由表4可知，試驗5的亞麻酸枇杷甾醇酯的酯化率最高，因此脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的最佳工藝條件為脂肪酶用量為7.8%，酸醇摩爾比為2.6∶1，反應溫度為50.0℃，反應時間為52.5 h。

圖9　酸醇摩爾比與反應溫度交互作用對酯化率影響的響應面Fig.9Response surface of effect of molar ratio of linolenate to phytosterol and reaction temperature interaction on the yield of esterification

圖10　酸醇摩爾比與反應時間交互作用對酯化率影響的響應面Fig.10Response surface of effect of molar ratio of linolenate to phytosterol and reaction time interaction on the yield of esterification

圖11　反應溫度與反應時間交互作用對酯化率影響的響應面Fig.11Response surface of effect of reaction temperature and reaction time interaction on the yield of esterification

表4　響應面優化條件驗證試驗設計表Table 4Response surface optimization condition verification test design table

3結論

響應面優化脂肪酶催化亞麻酸枇杷甾醇酯合成的最佳工藝條件為：脂肪酶pseudomonas為催化劑，在正己烷溶劑體系中，脂肪酶用量為7.8%，酸醇摩爾比為2.6∶1，反應溫度為50.0℃，反應時間為52.5 h，此時亞麻酸枇杷甾醇酯的酯化率達到79.59%。

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Optimization of Lipase Catalyzed Synthesis of Phytosterol Linolenate Esters

WANG Li-jun
（ZiBo Vocational Institute，Zibo 255314，Shandong，China）

This study mainly discussed the synthesis technology of phytosterol linolenate esters with lipase.With the yield of esterification of phytosterol linolenate esters as indicator，phytosterol linolenate esters were synthesis by using various lipases in organic media，and the lipase pseudomonas was selected for the best biocatalysts. The optimum synthesis conditions of phytosterol linolenate esters with lipase were determined by the response surface methodology，such as enzyme amount for 7.8%，molar ratio of linolenate to phytosterol for 2.6∶1，reaction temperature for 50.0℃，reaction time for 52.5 h in the n-hexane solvent systems，and the esterification of phytosterol linolenate esters reaches 79.59%.

phytosterol linolenate esters；lipase-catalyzed；synthesis；response surface optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.019

2014-11-19

王麗君（1972—），女（漢），講師，碩士研究生，研究方向：精細化學品及化學工程。