米根霉直接發酵玉米粉生產L-（+）-乳酸的研究

吳清林，鄒水洋，陳雁

（東莞理工學院化學與環境工程學院，廣東東莞523808）

米根霉直接發酵玉米粉生產L-（+）-乳酸的研究

吳清林，鄒水洋，陳雁

（東莞理工學院化學與環境工程學院，廣東東莞523808）

以米根霉（Rhizopus oryzae）NRRL395為生產菌，玉米粉為發酵基質，對玉米粉與水兩相分開滅菌冷卻后混合制成玉米粉懸濁液發酵生產L-（+）-乳酸的新工藝進行了研究。試驗結果表明，新工藝在不添加任何外源營養的情況下，以150 g/L天然玉米粉為培養基可產L-（+）-乳酸88.8 g/L，L-（+）-乳酸對玉米粉的轉化率達到59.2%，對葡萄糖的轉化率達到72.4%。該工藝克服了玉米粉在濃度較高情況下由于蒸煮滅菌冷卻后呈凝膠而不能被發酵的困難；且省去酶解糖化操作，使成本降低，具有較高的應用價值。

米根霉；玉米粉；L-（+）-乳酸；新工藝

L-（+）-乳酸是一種重要的化學品，在食品、醫藥及化工領域有著廣泛的用途［1］。L-（+）-乳酸的生產可由化學合成法和發酵法2種方法實現。然而該產品如果應用于食品或醫藥領域則發酵法生產的L-（+）-乳酸較為安全可靠。發酵法生產L-（+）-乳酸的菌種主要有細菌和真菌2類微生物，其中真菌自身能夠產生淀粉酶和糖化酶，可直接利用淀粉質原料進行發酵；發酵生產的L-（+）-乳酸純凈度較高，而高光學純度的L-（+）-乳酸是生產可生物降解高分子材料——聚乳酸所必需的［2］。因而利用根霉發酵生產L-（+）-乳酸在科研和生產上被廣泛采用。

聚乳酸能否在市場上取代聚乙烯等塑料產品取決于聚乳酸的原料——L-（+）-乳酸的生產成本能否有效降低。近年來人們在以米根霉為菌種發酵初級農產品生產L-（+）-乳酸研究中，圍繞菌種改良、發酵工藝條件優化以及反應器的選擇進行了大量的探索，然而在發酵工藝上始終沒有實現有效的突破。以農產品粗粉或淀粉為基質的發酵在蒸煮滅菌過程中會導致糊化，濃度高時冷卻后會變成凝膠狀，需要液化后才可以進行發酵。Hang等早在1989年就發文報道了米根霉可直接發酵玉米粉生產L-（+）-乳酸的成果［3］，然而，在玉米粉濃度較低時，蒸煮滅菌冷卻后的基質仍處于流質狀態，尚可被米根霉發酵（這種基質與水混合后蒸煮滅菌冷卻后發酵的工藝方法我們稱之為傳統工藝），但當玉米粉濃度較高時，蒸煮滅菌冷卻后的基質呈凝膠狀態，米根霉則無法將其發酵。然而低濃度基質的發酵導致L-（+）-乳酸產量低下，這是對能源、設備等資源的極大浪費，不利于降低生產成本。白冬梅等利用玉米生粉不經蒸煮滅菌直接進行了米根霉L-（+）-乳酸發酵的嘗試［4］，但雜菌污染成了影響發酵的主要問題。

為了實現在較高基質濃度條件下的發酵，我們設計了2個思路：其一是采用生料發酵，用抗生素抑制雜菌生長（試驗取得了良好的效果，將另文報道）；其二是將發酵基質與水分開滅菌，冷卻后混合，使基質在液相中呈懸濁液狀進行發酵（我們把這種固液兩相分開滅菌的方法稱之為新工藝）。新工藝能在較高基質濃度下發酵，且省去了添加外源淀粉酶、糖化酶的酶解糖化操作，對于降低L-（+）-乳酸的生產成本具有重要意義，有較高的應用價值。

1材料與方法

1.1菌種

米根霉（Rhizopus oryzae）NRRL395。

1.2培養基

1.2.1固體種子培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）。

1.2.2發酵培養基

碳源+氮源+無機鹽。

碳源：玉米粉（市售，烘干至恒重后備用）；

氮源（g/L）：2；

無機鹽（g/L）：KH2PO40.2，MgSO40.1，ZnSO4·7H2O 0.05，CaCO3100。

1.3培養方法

1.3.1種子培養

將米根霉接種到盛有PDA培養基的200 mL三角瓶中，于28℃下培養5 d～7 d長滿黑色孢子后冷藏。

1.3.2孢子懸液的制備

將長滿黑色孢子的米根霉菌種加入100 mL的無菌生理鹽水稀釋，制成約含有108/mL個米根霉孢子的孢子懸浮液。

1.3.3發酵培養方法

500 mL三角瓶，加液量100 mL，每瓶接種量5× 106個孢子，在180 r/min、33℃條件下搖床培養64 h。接種后即加入10 g滅菌CaCO3/瓶。

1.3.4傳統工藝

準確稱量一定量的玉米粉，加入100 mL水混勻于115℃滅菌30 min，然后按上述1.3.3中的發酵培養方法培養。

1.3.5新工藝

準確稱量一定量的玉米粉盛入500 mL三角瓶中，同時準確量取100 mL水于200 mL三角瓶中，分別在115℃滅菌30 min，冷卻后將二者混合制成懸濁液，再按上述1.3.3中的發酵培養方法培養。

1.3.6玉米粉雙酶糖分步發酵培養

準確稱取15.0 g玉米粉盛入500 mL三角瓶中，加入100 mL水混勻，然后加入0.05 g α-淀粉酶混合均勻后，于恒溫水浴鍋70℃保溫1 h，再加入糖化酶在30℃條件下糖化24 h，制成玉米粉雙酶糖，于115℃滅菌30 min，再按上述1.3.3中的發酵培養方法培養。

1.3.7玉米粉發酵培養

培養方法與1.3.5新工藝相同，但不添加氮源及除CaCO3外的無機鹽。

1.4分析方法

1.4.1L-（+）-乳酸鈣的測定

EDTA定鈣法。

1.4.2殘糖的測定

3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法。

1.4.3玉米粉水解物總糖含量的測定

采用酸解法將玉米粉中淀粉水解完全后用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測定還原糖含量，測得1.000 g干燥的玉米粉水解物總糖含量為0.818 27 g，以下乳酸對葡萄糖轉化率的計算以此為基準。

2結果與討論

2.1不同基質濃度條件下新工藝與傳統工藝的比較

對不同玉米粉濃度條件下新工藝與傳統工藝的發酵情況進行了考察。由試驗結果（表1、表2）可以看出：傳統工藝條件下，在玉米粉濃度超過150 g/L時，由于糊化玉米粉冷卻后變成凝膠狀固化，通氣性、傳質性喪失，米根霉不能將其發酵?；|濃度在120 g/L及以下時，糊化玉米粉還能呈流動狀態，有一定的通氣性，可以被米根霉發酵。但過低的基質濃度勢必造成效率低下，資源浪費，不利于總體生產成本的控制。在新工藝條件下，解決了傳統工藝中基質濃度較高不能被發酵的問題，但也并不是玉米粉的濃度越高越好，當濃度達到180 g/L時，L-（+）-乳酸產量雖有所提高，但轉化率降低了。所以新工藝條件下150 g/L的玉米粉是最適宜的基質濃度。

表1　不同濃度的玉米粉對米根霉L-（+）-乳酸發酵的影響（傳統工藝）Table 1Different concentrations of corn flour for the influence of Rhizopus oryzae fermentation to L-（+）-lactic acid（traditional technology）

表2　不同濃度的玉米粉對米根霉L-（+）-乳酸發酵的影響（新工藝）Table 2Different concentrations of corn flour for the influence of Rhizopus oryzae fermentation to L-（+）-lactic acid（new technology）

另外我們發現在新工藝的培養條件下米根霉菌絲體呈現分散的小球狀，類似煮熟綻開的米粒，而在葡萄糖基質中培養時菌絲體呈現一大塊扁平絮狀物。有研究表明，米根霉的球狀菌絲體比團塊狀、絮狀更適宜發酵產酸［5-6］。本試驗中米根霉菌絲球的形成可能是玉米顆粒表面的蠟質和角質可以起到固定化載體的作用，使菌絲體分散，這有利于傳質而促進發酵。

2.2玉米粉新工藝發酵與玉米粉雙酶糖分步發酵的比較

新工藝屬于直接發酵，也被稱為同步糖化發酵，而玉米粉雙酶糖是玉米粉經淀粉酶和糖化酶液化及糖化處理后獲得，所以玉米粉雙酶糖發酵屬于分步糖化發酵。我們比較了2種工藝的發酵情況，結果見表3。

表3　玉米粉新工藝發酵與玉米粉雙酶糖分步發酵的比較Table 3New technology of corn flour fermentation compared with the step fermentation of double enzyme sugar hydrolyzed from corn flour

由表3可以看出，玉米粉雙酶糖發酵的L-（+）-乳酸產量和轉化率高于新工藝，但由于雙酶糖的制備耗時耗能并使工藝步驟復雜化以及消費昂貴的酶制劑（淀粉酶液化需70℃保溫1 h，糖化酶糖化需30℃保溫24 h），工業生產條件下不利于生產成本的降低。新工藝L-（+）-乳酸發酵，在玉米粉濃度150 g/L時，產量接近90 g/L，對葡萄糖的轉化率達到了73.2%，對玉米干粉的轉化率達到了59.9%，也就是新工藝條件下發酵1 t玉米粉可以得到近600 kg的L-（+）-乳酸。

2.3新工藝條件下玉米粉中添加無機鹽及氮源與否的比較

玉米粉、大米粉等淀粉質農產品是米根霉的天然培養基，其除了主要含有淀粉外還含有蛋白質、脂肪以及均衡的維生素和礦物質等營養，在不添加無機鹽及氮素營養的情況下同樣能滿足米根霉生活的需要，因此我們在玉米粉中不添加氮源和無機鹽來考察米根霉的發酵情況，結果見表4。

表4　新工藝條件下玉米粉中添加無機鹽及氮素營養與否的比較Table 4The contrast of cornmeal adding inorganic salts and nitrogen nutrition or not in the new process

由表4可以看出玉米粉在不添加任何外源營養物的情況下，發酵效果跟對照相比幾乎沒有差別。說明利用玉米粉為基質，采用米根霉為菌種發酵生產L-（+）-乳酸，可以無需添加無機鹽以及氮源等因素。這樣就使發酵工藝進一步簡化，成本進一步降低。

3結論

以米根霉為菌種，以不添加任何外源營養物的天然玉米粉為培養基，以固液兩相分開滅菌然后制成玉米粉懸浮液的新工藝進行發酵生產L-（+）-乳酸，克服了傳統工藝固液兩相混合后滅菌基質糊化，在較高濃度下呈凝膠狀態而不能被發酵的困難。新工藝在不添加任何外源營養的情況下，以150 g/L天然玉米粉為培養基可產L-（+）-乳酸88.8 g/L，L-（+）-乳酸對對玉米粉的轉化率達到59.2%，對葡萄糖的轉化率達到72.4%。該工藝還可以省去酶解糖化操作，使工藝簡化、成本降低，具有較高的工業應用價值。依據新工藝的思想若能設計出相應的新型反應器，將為新工藝的工業化應用提供支持。

［1］Martinez F A C，Balciunas E M，Salgado J M，et al.Lactic acid properties，applications and production:a review［J］.Trends in Food Science＆Technology，2013，30（1）:70-83

［2］Ohara H.Poly-L-Lactic acid as biodegradable plastic［J］.Biosci Indust，1994，52（2）:642-644

［3］Hang Y D.Direct fermentation of corn to L-（+）-lactic acid by Rhizopus oryzae［J］.Biotechnol Lett，1989，11（4）:299-300

［4］白冬梅.玉米生粉發酵生產L-乳酸的研究［J］.化學工程，2002，30（3）:50-54

［5］Liao W，Liu Y，Frear C，et al．A new approach of pellet formation of a filamentousfungus-Rhizopusoryzae［J］．BioresourceTechnology，2007，98（18）:3415-3423

［6］章華婷，黃瑩，付永前.米根霉菌球特性對乳酸發酵的影響［J］.微生物學報，2015，55（3）:372-378

The Study on the Direct Fermentation of Corn to L-（+）-lactic Acid by Rhizopus oryzae

WU Qing-lin，ZOU Shui-yang，CHEN Yan
（College of Chemistry and Environment Engineering，Dongguan University of Technology，Dongguan 523808，Guangdong，China）

In the traditional fermentation process of L-（+）-lactic acid production，high amount of corn flour used to be autoclaved with certain amount water together to make growth medium.After cooling down，this medium formed sticky gel，which was hard for further fermentation process.In this study，corn flour was sterilized first，then suspended thoroughly in sterilized water to make the growth medium.With this medium，Rhizopus oryzae NRRL395 was used to produce lactic acid.The results showed that without adding any extra nutrition，88.8 g/L of L-（+）-lactic acid was produced with 150 g/L of corn flour growth medium.The convert rate of corn flour reached 59.2%，and convert rate of glucose reached 72.4%.In this fermentation process，no enzymatic saccharification process was need，reducing the total cost.Therefore，this new fermentation process showed high potential for the production of L-（+）-lactic acid.

Rhizopus oryzae；corn flour；L-（+）-lactic acid；new technology

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.017

2015-05-19

東莞市科技計劃項目（19）

吳清林（1963—），男（漢），講師，博士，研究方向：生物化學工程。