不同途徑移植脂肪來源干細胞對創傷性腦損傷大鼠空間記憶的影響

天津醫科大學第二醫院（300211）吳建國 李宏 徐德生 王德勝 王偉

外傷性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是神經外科常見疾病，其致殘率及致死率占全身各器官損傷之首。腦創傷后患者常伴有高級認知功能障礙，出現不同程度學習記憶能力下降，研究發現間充質干細胞可以改善腦創傷大鼠的認知功能[1]，且有研究認為腦損傷局部移植效果優于靜脈移植，但實驗多為單次注射移植[2]，本實驗采用脂肪來源干細胞（adipose tissuederived stem cells，ADSCs）作為移植細胞。我們研究的內容是比較多次尾靜脈移植與腦損傷局部單次移植在改善創傷性腦損傷大鼠空間記憶以及海馬組織中腦源性神經生長因子mRNA的表達之間的差異。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級雌性Sprague-Dawley大鼠3只，體質量200g，清潔級Sprague-Dawley大鼠80只，雌雄各半，體質量250～300 g，購于中國軍事醫學科學院動物實驗室。實驗過程中對動物的處置符合2006年中華人民共和國科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》的規定。

1.1.2 試劑及儀器設備 液壓打擊裝置（美國弗吉尼亞大學），小動物立體定向儀（山西萬東醫療器械廠），ABI 7600 PCR儀(美國ABI公司)，Morris水迷宮, 超凈化工作臺（美國Thermo scientific ），流式細胞儀（美國BD公司），RNA提取試劑盒（北京天根生物科技有限公司），CD90，CD105，CD73，CD44，CD34，HLA-DR單克隆抗體（美國R&D公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠脂肪來源干細胞的分離、培養和鑒定 參照Zuk等[3]的方法略加改良進行，取200g的SD大鼠3只，3%水合氯醛腹腔注射麻醉后斷頸處死，無菌條件下取大鼠腹部脂肪組織，用無菌D-Hank's溶液反復沖洗標本，以去除污染物和紅細胞。然后用I型膠原酶（0.075%）在37℃、150rpm 恒溫振蕩水浴搖床內消化樣品30min。以去除細胞外基質，然后用等量體積的含有10%FBS的DMEM/F12培養基中和膠原酶活性，1200g離心10min，棄去上清，沉淀用紅細胞裂解液重懸，100目篩網過濾，1200g離心5min，棄上清，沉淀重懸，細胞懸液用細胞記數板記數，以1.5×105/ml接種于75cm2培養瓶中，培養瓶中加入含10%胎牛血清及雙抗的DMEM/F12培養基，在37℃，5%CO2，飽和濕度孵箱中過夜培養，然后用PBS反復沖洗以去除未貼壁的殘存的血細胞，當細胞達70%～80%匯合時，胰酶常規消化，細胞按照1∶3進行傳代。第4代細胞進行細胞學組織觀察、表面標記物的流式細胞學檢測以及成骨、成脂等多向分化培養，并制備成終濃度為以2.0×1012/L的單細胞懸液，待移植時用。

附表1 傷后28天各組Morris水迷宮試驗結果（）

附表1 傷后28天各組Morris水迷宮試驗結果（）

注：**P<0.05；*與對照組比較P<0.05；a與（3）比較 P>0.05。

組別（group） 鼠數（n） 逃避潛伏（s） 空間搜索目標象限路程（%） 目標象限時間（%） 穿越平臺次（次）假傷組(1) 6 24.33±4.84* 30.67±3.67* 31.00±3.22* 7.83±1.17*對照組(2) 8 47.45±15.36 14.25±2.92 14.75±1.98 2.75±0.771尾靜脈移植(3) 8 35.44±4.88* 26.11±3.10*a 22.78±2.17*a 6.00±1.22*a腦內移植組(4) 8 35.17±5.78* 24.56±2.88* 22.11±2.37* 5.78±1.20*P [（3）∶（4）] 0.948 0.542 0.572 0.632 F 7.252** 36.725** 42.577** 26.891**

附表2 各組不同時間BDNF mRNA的表達（）

附表2 各組不同時間BDNF mRNA的表達（）

注：**P<0.05；*與（2）比較P<0.05；a與（3）比較 P>0.05。

組別（group） 鼠數（n） 7d 14d 28d假傷組（1） 5 0.0955±0.0151 0.0844±0.1237 0.0824±0.0086對照組（2） 5 1.3389±0.0948 0.1034±0.1688 0.0952±0.0103尾靜脈移植（3） 5 1.5860±0.1953* 2.3943±0.3346* 1.7405±0.2598*腦內移植組（4) 5 2.6606±0.2383* 2.4591±0.2781*a 1.8509±0.2189*a P [（3）∶（4）] 0.028 0.644 0.320 F 213.04** 191.25** 168.40**

附圖1 酶消化法得到的ADSC表面抗原流式檢測結果（設定PE顯示為黑色，FITC顯示為灰色）

1.2.2 實驗動物分組及TBI模型制備 采用側方液壓打擊法制作大鼠海馬神經元創傷模型，打擊能量為1.7～2.2atm[4][5]。將存活的76只大鼠隨機分為4組：①尾靜脈移植組：20只，分別于傷后1d、3d、7d動物麻醉后，2.0×106ADSCs自尾靜脈注入體內；②腦內移植組：20只，傷后1d固定于立體定向儀上，常規備皮消毒后，根據大鼠立體定向圖譜，通過微量注射器于海馬背側CA1區注射2.0×106ADSCs；③對照組：20只，造模成功后不做任何處理；④假傷組：16只，僅行頭皮切開及鉆孔，不做打擊。

1.2.3 Morris水迷宮實驗 創傷性腦損傷后23d行Morris水迷宮檢測[6]，實驗共5 d，定位航行實驗：記錄每次大鼠找到平臺的時間(逃避潛伏期)。每天4次實驗，分別從東南西北4個入水點隨機放入水池，面向池壁，如在120 s內不能發現平臺，將其放置于平臺上30 s，每次實驗間隔30 s，取4次測試的平均值做為當天的逃避潛伏期。空間搜索實驗：第5天完成定位航行后，撤走站臺，選擇站臺對面入水點，將大鼠面對盆壁放入水中，通過攝像機記錄大鼠在2min內的游泳軌跡，應用荷蘭Noldus公司Ethovision水迷宮分析系統計算大鼠在原站臺所在象限的游泳時間、距離在水池內游泳的總時間、總距離的比值百分數和穿越原跳臺次數以判斷大鼠的學習和記憶能力。

附圖2 多系分化后染色結果：A 成骨分化茜紅素染色，B 成脂分化油紅-O染色（×400）

1.2.4 RT-PCR法檢測BDNF mRNA表達分別于損傷后7d、14d、28d，4組隨機各取5只大鼠麻醉處死，開顱取損傷側海馬組織進行RT-PCR相關檢測，首先抽提總mRNA，以反轉錄法(RT法)先合成cDNA，再進行PCR擴增；引物序列分別為：BDNF：F5’-AGA AGA GGA GGC TCC AAAGG-3’，R5’-AAA CAT CCG AGG ACA AGGTG-3’； 預擴增產物長為235 bp 。β-actin ：F5’-CCA TCA TGA AGT GTG ACG TTG-3’，R5’-ACA GAG TAC TTG CGC TCA GGA-3’；預擴增產物長為175 bp。PCR反應條件：94 ℃4 min，94 ℃ 35 s→57℃ 30 s→72 ℃ 30 s ，循環29次后，于72 ℃延伸7 min，每管適時加入內參β-actin引物，內參擴增30次。應用標準曲線法得到BDNF mRNA的相對表達量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 ADSC的生物學特征和鑒定

ADSCs的細胞形態符合間充質細胞的表現，表面標志物流式細胞儀檢測結果顯示：P4細胞CD90，CD105，CD73陽性率分別為（99.02±0.35）%、（98.89±0.64）%、（99.01±0.84）%，而CD44，CD34，HLA-DR陽性率為（1.01±0.34）%，（2.43±0.21）%，（1.34±0.46）%。見附圖1，因此可證明本實驗所獲得的ADSCs具有間充質干細胞的表面抗原特征，在成骨培養體系中培養3周后，茜紅素染色陽性(見附圖2-A)；在成脂肪培養體系中培養3周后，油紅-O染色陽性(見附圖2-B)；這說明所得到的細胞具有多向分化能力。

2.2 大鼠Morris水迷宮行為學檢測

在Morris水迷宮檢測前,對照組、尾靜脈移植組、腦內移植組分別有2只、1只、1只大鼠死亡，各組平均潛伏時間均逐漸縮短，與TBI組相比，尾靜脈移植組以及腦內移植組的平均潛伏時間減少，而穿越原平臺次數、目標象限游泳時間占總時間的百分比增加，差別有統計學意義（P＜0.001) ，而尾靜脈移植組以及腦內移植組兩組間差異無統計學意義（P＞0.05),見附表1。

2.3 RT-PCR檢測各組BDNF mRNA的表達傷后7d、14d、28d，腦內移植組、尾靜脈移植組BDNF mRNA的相對表達量均高于對照組及假傷組，傷后7d時腦內移植組BDNF mRNA的相對表達量高于尾靜脈移植組，差異有顯著性意義(P< 0.05)，而在14d及28d時腦內移植組、尾靜脈移植組兩組之間無顯著性差異(P> 0.05)，見附表2。

3 討論

創傷性腦損傷是常見的意外傷害，有較高的致死率和致殘率，且存活的患者也常會出現各種神經功能障礙，其中學習和記憶障礙等認知功能障礙是腦創傷患者最常見的并發癥之一，嚴重影響該類患者的生活質量，目前的治療方法是有限的。應用細胞治療因創傷性腦損傷所造成的中樞神經系統損傷或功能障礙是新近發展起來并極有前景的神經系統疾病治療策略之一。ADSCs除了與其他干細胞相似的自我更新和多潛能性之外，ADSCs還具有避免了免疫排斥反應，細胞來源較廣泛，易于采集、制備、保存、對供體損傷小以及穩定轉染和表達外源性基因等優點[4]。另外ADSCs可通過自體移植，因此不會涉及到社會、倫理及法律等諸多問題，是理想的移植用種子細胞。目前認為間充質細胞治療腦損傷的可能的機制有促進生長因子的分泌，通過細胞間融合或接觸交換基因和蛋白質，誘導血管生成以及免疫調節[7]。

移植移植的成功在很大程度上取決于移植物來源，移植時間窗及移植途徑的選擇。既往研究認為經尾靜脈移植后細胞通過血腦屏障最終定植在大鼠腦組織損傷部位的數目較少，與腦損傷區移植相比無論是組織學還是功能學上治療效果都較之略差，因為經尾靜脈進行細胞移植，細胞必須先經過體循環才有可能達到損傷部位，在這期間大部分細胞會被機體的免疫系統所清除，進而傾向于選擇腦損傷區移植，但腦損傷區移植可造成二次損傷，Mahmood等[8]研究表明經靜脈移植也可明顯改善腦損傷后大鼠的神經功能，認為MSC移植后主要是通過促進各種神經生長因子分泌而達到改善神經功能的，本實驗通過經尾靜脈多次移植增加移植的細胞數和作用時間進而發現其在定位航行能力和空間探索能力改善、BDNF mRNA的表達等方面與腦損傷區移植組間無顯著差異，說明經尾靜脈多次移植可以取得與腦損傷區移植相當的效果，且更加安全，對于復合性外傷而言，靜脈移植在改善腦功能的同時，是否有利于其他損傷器官功能的修復尚需進一步研究明確。

總之，ADSCs移植為創傷后因海馬神經元損傷而導致的記憶和認知功能障礙的改善提供了一種新的治療選擇，具有廣闊的臨床應用前景，不同移植途徑在改善空間記憶障礙方面并無顯著差別。